胶体金免疫层析法快速检测烟叶中三唑酮残留量

楼小华，高川川，朱文静，巴金莎，扶胜，杨梅，易重任

1贵州省烟草质量监督检测站，贵州省贵阳市观山湖区龙滩坝路贵阳 550025；2贵州勤邦食品安全科学技术有限公司，贵州省贵阳经济技术开发区科技路1号贵阳 550009

胶体金免疫层析法快速检测烟叶中三唑酮残留量

楼小华1，高川川1，朱文静1，巴金莎1，扶胜2，杨梅2，易重任2

1贵州省烟草质量监督检测站，贵州省贵阳市观山湖区龙滩坝路贵阳 550025；2贵州勤邦食品安全科学技术有限公司，贵州省贵阳经济技术开发区科技路1号贵阳 550009

[目的]应用胶体金免疫层析技术建立一种快速检测烟叶中三唑酮残留量的方法。[方法]采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，并将其与抗三唑酮抗体标记制备得金标抗体。三唑酮-OVA偶联物和残留量羊抗鼠IgG抗体分别结合于醋酸纤维膜上，依次将样品垫、醋酸纤维膜和吸水纸组装，切割成胶体金试纸条。[结果]测试结果表明，三唑酮胶体金试纸条检测烟叶中三唑酮、三唑醇残留量的灵敏度为1mg/kg，检测时间为5~10 min，特异性高，重复性好，与气相色谱-串联质谱检测法符合率为98%。

胶体金免疫层析法；烟叶；农药残留；三唑酮

三唑酮（Triadimefon）是一种高效、广谱、持效期长、内吸性三唑类低毒杀菌剂，广泛应用于我国农业生产中玉米、高粱、烟草等农作物锈病和白粉病的防治[1-2]。研究发现，三唑酮及其代谢产物三唑醇会产生神经、生殖和基因毒性，并有致癌和致畸性[3-6]。GB2763—2014《食品中农药最大残留限量》[7]规定了三唑酮及其代谢产物三唑醇在粮谷、油料、蔬菜等作物上的限量要求，因此，对三唑酮残留量的检测，乃至快速检测，就具有重要意义。

目前，烟草中三唑酮的检测方法主要有气相色谱（GC）法[8]、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法[9]、气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）法[10-11]等。这些方法准确性好、灵敏度高，可以同时测定多种农药残留，但是所需仪器设备昂贵，且样品的前处理复杂、繁琐费时，无法现场操作，不能在烟叶工商交接时及时对样品农药残留作出评价。胶体金免疫层析技术（Colloidal Gold Immunochromatography Assay，GICA）是一种以胶体金作为标记物应用于检测特定抗原或抗体的一种新型免疫标记技术，它是建立在胶体金标记技术、单克隆抗体技术、免疫层析技术基础上的一种快速诊断技术。近十年来，该项技术在禽流感、家畜疫病、微生物、农药残留、食品药物残留检测方面开始推广应用，检测的对象包括激素、重金属、抗生素、农药、抗病毒试剂、激动剂、毒素及过敏原等[12-17]。本研究以制备的高亲和力和高特异性的三唑酮单克隆抗体为基础，建立了烟叶中三唑酮胶体金试纸条检测方法，并对试纸条进行了性能测试。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 农药纯品：三唑酮固体纯品，含量98.0%，购于国家标准物质中心。

1.1.2 烟叶样品：鲜烟叶和烤后干烟叶，采集于贵州省烟区（空白样和含三唑酮、三唑醇残留样）。

1.1.3 胶体金制备材料及仪器：抗三唑酮单克隆抗体、三唑酮偶联抗原、羊抗鼠IgG抗体，贵州勤邦食品安全科学技术有限公司自制；牛血清蛋白（BSA）、氯金酸（HAuCl4·4H2O，分析纯），均由美国Sigma公司提供；甲醇、氯化钠、柠檬酸三钠、碳酸钾等常规试剂，均为分析纯；玻璃纤维、硝酸纤维素膜（NC膜）、样品吸收垫、PVC底板、吸水垫、CT 300数控切条机，均由上海金标生物科技有限公司提供；XYZ3000点膜仪，由Bio-Dot公司提供；TDL-40B低速大容量离心机、TGL-20b R高速冷冻离心机，由上海安亭科学仪器厂提供；90-2磁力搅拌器，由上海振荣科学仪器有限公司提供；双蒸去离子水，自制。

1.1.4 验证用仪器及试剂：Thermo Scienti fi c Trace GC Ultra-TSQ Quantum XLS气相色谱–三重四极杆串联质谱联用仪，由美国ThermoFisher Scienti fi c公司提供；Labnet VX200漩涡振荡器，由美国Labnet公司提供；Centurion K-241高速离心机，由英国Centurion公司提供；乙腈（色谱纯）、甲苯（色谱纯），由德国Merck公司提供；超纯水：电阻率18.2MΩ，自制；QuEChERS试剂盒（试剂包A：4 g无水硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠；试剂包B：150 mg无水硫酸镁和50 mg N-丙基乙二胺键合固相吸附剂），由美国Agilent公司提供。

1.2 方法

1.2.1 胶体金的制备

将氯金酸用双蒸去离子水稀释至质量分数为0.01%，于磁力加热搅拌器上搅拌煮沸后，每100 mL中加入2.5 mL 1%的柠檬酸三钠，继续搅拌加热至溶液呈红色，冷却至室温，按体积损失补足失水，于4℃保存备用，保存时间不超过半年。

1.2.2 单克隆抗体-胶体金标记物的制备

用0.2 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至7.0，将一定量自制的三唑酮单克隆抗体加入至胶体金溶液，搅拌均匀后静置10 min；然后加入质量分数为10%的BSA直至其质量分数为1%，搅拌均匀后静置10 min。4 ℃条件下12000 r/min离心40 min，小心吸去上清液，用磷酸缓冲液重新溶解沉淀，置于4 ℃冰箱中备用，保存时间不超过半年。

1.2.3 试纸条的制备与组装

将样品垫置于含0.3 % BSA、0.05 mol/L的磷酸缓冲液（PH7.2）中浸泡30 s，37℃干燥4 h。用喷膜仪在玻璃纤维上喷金标抗体，喷量为5 µL/cm，37℃干燥2 h。偶联抗原三唑酮-OVA用0.02 mol/L PBS（PH7.4）稀释至0.5 mg/mL，用喷膜仪喷于NC膜（反应膜）上，喷量为2 µL/cm，为检测线；在检测线上5mm处喷涂羊抗鼠IgG抗体（0.3 mg/mL），喷量为2 µL/cm为质控线，37℃干燥2h。将样品吸收垫、胶体金结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次黏贴在底板上，切割成4 mm宽的试纸条并装入塑料卡壳中，制成检测试纸条。该试纸条对三唑酮、三唑醇两个目标物的交叉率为100%，即同时对以上两个化合物均有响应。试纸条的结构见图1。

1.2.4 试纸条结果判读

如图2所示，T线（检测线）显色比C线（质控线）显色深或显色一致，均表示组织样本中三唑酮和三唑醇药物浓度低于检测限，为阴性；T线显色比C线显色浅或T线不显色，表示组织样本中三唑酮和三唑醇药物浓度等于或高于检测限，为阳性；若未出现C线，则表示操作过程不正确或试纸条已变质失效。样品实测试纸条实物图见图3。

图1 试纸条剖面结构图Fig. 1 Pro fi le of rapid detection strip

图2 试纸条结果示意图Fig. 2 Schematic diagram of rapid test strip

图3 试纸条实物图Fig.3 Real fi gure of rapid test strip

1.2.5 试纸条检测限实验

取空白烟叶样本的甲醇提取液，在其中分别添加三唑酮+三唑醇（1:1）至终浓度为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/kg。试纸条放平，取配制好的待测样品60 μL加入试纸条加样孔中，液体流动开始计时，10 min后观察检测结果。每个质量浓度重复5次，根据实验结果判断检测试纸的检测限。

1.2.6 试纸条重复性实验

根据农医发﹝2005﹞17号文件，胶体金免疫层析法是一种定性方法，重复性以假阳性率和假阴性率表示[18]。取不同批次的3批胶体金试纸，分别检测阴性烟叶样本和添加了三唑酮的阳性烟叶样本各20份，计算其假阳性率和假阴性率：

1.2.7 试纸条特异性实验

考虑到烟叶生产中经常会出现与三唑酮同时使用或结构类似的有机氮或杂环类农药如甲霜灵、吡虫啉、多菌灵、烯唑醇、丙环唑、戊唑醇、腈菌唑等的干扰，特进行特异性实验。分别向空白烟叶样本提取液中添加上述农药至浓度为0、1、5、10、20、50、100mg/kg。用试纸条进行检验，不同农药每个浓度重复3次，根据试验结果判定试纸条的特异性。

1.2.8 试纸条检测操作

1.2.8.1 样品提取

鲜烟叶：检测前将样剪成2×2mm2碎片。称取1.0±0.05 g样品置于含5 mL甲醇的10 mL螺口玻璃管中，拧紧管盖，手持剧烈振荡1 min。静置5 min后移取0.1 mL上层清液加入到0.9 mL磷酸缓冲盐溶液(0.1 M)中。

干烟叶：检测前将样品粉碎成20~40目粒度。称取粉末状样品1.0±0.05 g至含5 mL甲醇的10 mL螺口玻璃管中，拧紧管盖，手持剧烈振荡1 min。静置5 min后移取0.1 mL上层清液加入到0.9 mL磷酸缓冲盐溶液(0.1 M)中。

1.2.8.2 试纸条检测

用吸管吸取1.2.8.1中制得待检样品溶液垂直滴加2~3滴于试纸条加样孔，液体流动时开始计时，反应5 min，对试纸条显示的实验结果进行判读，其他时间判定无效。

1.2.9 试纸条符合性实验

取50份烟叶样本（鲜烟叶和烤后烟叶各占50%），分别用胶体金免疫层析法和仪器方法（气相色谱-串联质谱联用法，GC-MS/MS）测定其中三唑酮和三唑醇残留总量。当样品中三唑酮和三唑醇残留总量低于胶体金试纸条检测限，判为阴性，试纸条阴性结果用“-”表示，仪器检测法低于检测限的结果用“ND”表示；当样品中三唑酮和三唑醇残留总量高于胶体金试纸条检测限浓度，判为阳性，试纸条阳性结果用“+”表示，仪器检测法阳性结果用实测值表示。仪器检测方法参照YQ/T 47.1—2014《烟草及烟草制品多种农药残留量的测定第1部分：气相色谱-串联质谱联用法》[19]所述进行操作。

1.2.10 试纸条稳定性实验

选取试纸条3批，分别于4℃、25℃、37 ℃干燥条件下保存1、3、6、9、12、15个月。取出不同保存时段的试纸条对添加三唑酮标准品浓度分别为0、1 mg/kg的烟叶样本进行检测，每个样本重复5次，观察不同保存时间的试纸条检测结果，确定试纸条的保存期。

2 结果与讨论

2.1 试纸条检测限

用试纸条检测三唑酮浓度分别为0.25、0.5、1、1.5、2 mg/kg的烟叶样本提取液。按照1.2.5所述方法进行检测，确定检测限。以只出现C线时的最低标准品质量浓度作为试纸条的检测限，由此得出，该试纸条检测限为 1 mg/kg。检测结果见表1。

2.2 试纸条重复性

用不同批次的3批胶体金试纸条分别对20份阳性和阴性烟叶样本进行检测，检测结果如表2所示。由表2可以看出，阳性符合率为100%，即假阴性率为0；阴性符合率为100%，即假阳性率为0。实验证明不同批次生产的检测试纸条检测结果稳定可靠，具有良好的重复性。

2.3 试纸条特异性

试纸条与烟叶中常见的其他药物交叉反应结果如表3所示。测定结果表明，胶体金试纸与甲霜灵、吡虫啉、多菌灵等农药不存在交叉反应，因此胶体金试纸条对烟叶中的三唑酮残留的检测具有较高的特异性。

表1 烟叶中三唑酮快速检测试纸条检测限测试结果Tab. 1 Detection limit of triadimefon rapid test strip in tobacco leaves

表2 不同批次三唑酮快速检测试纸条重复性检测结果Tab. 2 Different batches of triadimefon rapid test strip reproducible test results

表3 烟叶中三唑酮快速检测试纸条特异性检测结果Tab. 3 Results of speci fi city of triadimefon rapid test strip in tobacco leaves

2.4 试纸条符合性

利用胶体金免疫层析法、GC-MS/MS法对50份烟叶盲样进行对比测定，前者阴阳性判断的临界值设为1 mg/kg，后者高于检测限的样本均以实测值表示，实验结果如表4所示。胶体金快速检测试纸条检出阳性样本30份，阴性样本20份；GC-MS/MS检测结果显示，共有29份烟叶样本中三唑酮残留量超过1 mg/kg，且样本编号与试纸条检出阳性样品编号相同，其中13号样本仪器测试结果为ND，胶体金免疫层析法为阳性，表现出了假阳性。另有6份样本中仪器检测结果在0.21～0.86mg/kg之间（低于1 mg/kg），胶体金免疫层析法亦为阴性。表明胶体金试纸与仪器检测结果一致性程度较高，检测符合率为98%。

2.5 试纸条稳定性

检测试纸条在分别于4、25、37 ℃温度下保存15个月，对不同保存时间的试纸条进行抽检，观察其外观、准确性、敏感性随时间的变化情况。实验结果表明，检测试纸条在4~37℃温度下至少能保存9个月。

表4 胶体金免疫层析法与气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）检测结果对比Tab. 4 Comparison of detecting results between gold immunochromatography assay and GC-MS/MS

表5 三唑酮快速检测试纸条稳定性检测结果Tab. 5 Results of stability of triadimefon rapid test strip

3 结论

本研究采用胶体金免疫层析法检测烟叶样本中三唑酮和三唑醇残留，以此验证三唑酮胶体金试纸条检测效果，并将其检测效果与GC-MS/MS法作对照。结果表明，三唑酮胶体金试纸条的检测限为1 mg/kg，对烟叶生产中常用农药甲霜灵、吡虫啉、多菌灵等无交叉反应，特异性良好，假阳性率和假阴性率均为0，检测时间为5~10 min，能够在4~37℃干燥条件下至少保存9个月。与仪器检测方法相比，本法具有快速、简便、仪器化程度低，经济实用等优点，适合我国基层烟站对大批量样品集中筛查检测和待采收烟叶的田间现场快速检测。但是由于胶体金免疫层析法主要通过目测颜色来判断结果，比较主观，可能出现假阳性问题，因此，如需对检测中出现的阳性样本进行仲裁，还需要用相关仪器方法进行进一步确证。

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：LOU Xiaohua, GAO Chuanchuan, ZHU Wenjing, et al. Rapid detection of triadimefon residues in tobacco leaves with colloidal gold immunochromatography [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(1)

*Corresponding author. Email：louxh6311@sina.com

Rapid detection of triadimefon residues in tobacco leaves with colloidal gold immunochromatography

LOU Xiaohua1*, GAO Chuanchuan1, ZHU Wenjing1,BA Jinsha1,FUSheng2, YangMei2, YI Zhongren2
1 Guizhou Tobacco Quality Supervision Station, Guiyang 550025, China;2 Guizhou Kwinbon Food Safety Science And Technology Co.,Ltd., Guiyang 550009, China

Gold immunochromatography assay was adopted to establish a rapid detection method for triadimefon residues in tobacco leaves. Colloidal gold was prepared by sodium citrate method, and was then conjugated to triadimefon antibodies. Triadimefon-OVA and anti-mouse goat immunoglobulins were jet-positioned onto a nitrocellulose membrane. Sample pad, gold jed pad, nitrocellulose membrane and absorbent paper were assembled and cut into detecting card, respectively. Results showed that the sensitivity of rapid triadimefon visual detection limit is 1 mg/kg for residues of triadimefon and triadimenol in tobacco leaves, and detection time was 5～10 min. Repeatability was good, and it gave almost no false positive or negative results compared with gas chromatography-tandem mass spectrometry.

gold immunochromatography; tobacco leaf; pesticide residue; triadimefon

楼小华，高川川，朱文静，等. 胶体金免疫层析法快速检测烟叶中三唑酮残留量[J]. 中国烟草学报，2017,23（1）

贵州省烟草专卖局（公司）科技项目(No. 201518)

楼小华，本科，高级工程师，从事烟草质量安全研究，Tel：0851-84117148，Email：louxh6311@sina.com

2016-08-30；< class="emphasis_bold">网络出版日期：

日期：2017-01-25