烟草类型及贮藏环境对烟叶氮氧化物形成的影响

王俊，张梦玥，史宏志，靳彤，周骏，杨惠娟，白若石，张晨

1 河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室/烟草农业减害研究中心，河南 郑州450002；

2 上海烟草集团北京卷烟厂，北京100024

烟草类型及贮藏环境对烟叶氮氧化物形成的影响

王俊1，张梦玥1，史宏志1，靳彤1，周骏2，杨惠娟1，白若石2，张晨2

1 河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室/烟草农业减害研究中心，河南 郑州450002；

2 上海烟草集团北京卷烟厂，北京100024

为明确烟草类型及贮藏环境对烟叶氮氧化物形成的影响，利用真空干燥器设置了密闭的环境，检测和分析了不同烟叶类型、贮藏温度和时间及含水率条件下环境中气态NOx（Nitrogen oxides）含量的差异。结果表明：贮藏过程中烟叶形成的氮氧化物以NO为主。相同的贮藏条件下，白肋烟产生的NOx浓度高出烤烟约9倍。当贮藏温度从10℃提高到50℃，处理48 h 后白肋烟样品产生的NO和NO2浓度逐渐升高。白肋烟经过50℃贮藏2 h后，即可检测出NOx，且随着处理时间的延长NOx的浓度不断增加。相同贮藏温度下，含水率高于18%的烟叶产生的NO和NOx 浓度与含水率11.03%和12.29%相比显著降低；烟叶隔离加入活性炭后，烟叶贮藏环境中的NOx浓度显著降低。研究表明，贮藏环境控制可以抑制和减少烟叶本身氮氧化物的产生，从而减少贮藏过程中烟叶TSNA的形成。

烟叶；贮藏温度；含水率；氮氧化物

氮氧化物（NOx）是自然界常见的一类化合物，已报道卷烟烟气中主要存在三种氮氧化物：一氧化氮（NO）、二氧化氮（NO2）和一氧化二氮（N2O），其中NO为主要成分[1-3]。烟气中的NOx主要是由烟草中的硝酸盐、亚硝酸盐以及蛋白质和氨基酸等经高温热解而成[4-5]。NOx是卷烟烟气中的主要有害成分之一，烟气中的NO和NO2除了可以直接参与人机体内的自由基代谢外[6]，还能与烟草生物碱反应生成烟草特有亚硝胺（TSNAs）[7]。TSNAs是烟草生物碱发生亚硝化反应生成存在于烟叶和烟气中的致癌物质，其形成和积累主要在烟叶的调制和贮藏过程中[8-9]，与NOx有密切的关系。调制过程中，烟叶暴露于微量的NOx即可生成TSNAs[10-11]；而明火烘烤能够产生一定浓度的燃烧副产物NOx，明显地促进烟叶烘烤过程中TSNAs的形成[2]。Saito等[12]的研究证明存储在密封条件下的白肋烟通入低含量NO气体后，TSNAs的增幅明显。本课题组前期的研究表明，贮藏条件能够影响烟叶TSNAs的形成，尤其是高温贮藏后烟叶TSNAs的含量显著提高，增加幅度与硝态氮含量[13-14]、贮藏温度、烟叶含水率密切相关[15-16]，但关于贮藏过程中烟叶形成氮氧化物的研究鲜见报道，贮藏环境中NOx的产生量及与贮藏环境、烟叶硝态氮含量等的关系尚不清楚。为了明确烟叶类型以及贮藏环境对烟叶NOx形成的影响，本试验利用玻璃真空干燥器设置了密闭的环境，分析了不同类型、贮藏温度和时间以及含水率的烟叶产生NOx含量的差异，旨在进一步揭示烟叶贮藏过程中TSNAs的形成机理，为制定抑制烟叶贮藏过程中TSNAs形成的有效技术提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

所用烟叶为白肋烟TN86和烤烟中烟100，中部叶，分别产自四川达州和河南襄县。将白肋烟和烤烟的烟叶去除主脉，分别切成烟丝混匀，待用。白肋烟和烤烟的含水率为13.4%，NO3-N的含量分别为1935μg/g 和 201μg/g。

1.2 试验方法

1.2.1 烤烟和白肋烟贮藏过程中氮氧化物的形成

称取白肋烟和烤烟各40 g分别放置在棕色真空玻璃干燥器（直径20cm，下同）中，密封后置于50℃恒温恒湿箱中，设置相对湿度60%，处理48 h。每个处理设置3个重复。处理后，采用烘箱干燥法[17]测定样品的含水率为12.3%。

1.2.2 贮藏环境对白肋烟氮氧化物形成的影响

1.2.2.1 贮藏温度对白肋烟氮氧化物形成的影响

分别称取40 g白肋烟叶放在真空干燥器中，密封后，置于10℃、20℃、30℃、40℃、50℃恒温恒湿箱中，设置相对湿度60%，处理48 h后，抽取干燥器中的气体至集气袋中测定氮氧化物浓度。每个处理设置3个重复。

1.2.2.2 贮藏时间对白肋烟氮氧化物形成的影响

称取充分混匀后白肋烟样品8个（40 g/个）放在真空干燥器中，密封后，置于50℃恒温恒湿箱中分别处理 2 h、4 h、8 h、16 h、20 h、24 h、40 h、48 h 后，抽取干燥器中的气体进行测定。每个处理设置3个重复。

1.2.2.3 烟叶含水率对白肋烟氮氧化物形成的影响

将白肋烟烟叶与饱和度分别为100%、60%和30%的K2CO3溶液，各200mL隔离放置于玻璃干燥器中，在24.5℃培养箱中处理4d后[15-16]，得到含水率差异明显的烟叶。将已知低含水率（4.23%和6.20%）、中等含水率（11.03%和12.29%）和高含水率（18.17%和20.53%）的烟叶分别放置到真空干燥器中，密封置于30℃恒温恒湿箱内培养24 h后，抽取干燥器内的气体进行测定。每个处理设置3个重复。处理后，样品的含水率平均减少了0.5%。

1.2.3 吸附材料对白肋烟氮氧化物形成的影响

称取白肋烟叶40 g分别与2 g活性炭（AC,Activated carbon）和5 g纳米二氧化硅（NS,Nanosilica）隔离放置在真空干燥器中，密封后置于30℃恒温恒湿箱中处理48 h，抽取干燥器中的气体进行测定。吸附材料使用前均置于100℃烘箱中活化30min。以不添加吸附材料的白肋烟为对照。每个处理设置3个重复。处理后，烟叶的含水率由13.4%降低到12.8%。

1.3 氮氧化物气体（NOx）的测定

标准气体的配置：采用Dynamic Gas Calibrator（动态气体校正仪）（Model 146i；Thermo Scienti fi c，U.S.A.EPA）配气装置将标准NO气体（N2保护；组分含量：69.8×10-6mol/mol；中国计量科学研究院/国家标准物质研究中心）配置成低浓度（1×10-6）的NOx混合气体，以空气中的NOx含量作为零点。

测定方法：各个处理结束后，取出真空干燥器，连接真空泵[GAST，DOA-P504-BN；GAST Manufacturing，A Unit of Idex Corporation，（MICH）U.S.A.]抽取干燥器内的气体至集气袋中，约25 s。拔掉集气袋，使用NO-NO2-NOx 分析仪（Model 42i；Thermo Scientific，U.S.A.EPA；Reference method RFNA-1289 -074）利用化学发光的原理进行测定[18]。

1.4 数据处理

运用Excel 2007、SPSS 20.0软件对数据进行方差分析、t检验以及线性和非线性方程拟合，采用Origin 8.5软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 烤烟和白肋烟贮藏过程中氮氧化物的形成

将烤烟和白肋烟分别放在真空干燥器中，置于50℃处理48 h后测定氮氧化物的浓度见表1。高温处理后，两类烟叶产生的氮氧化物以NO为主，NO2的浓度较低。处理48 h后，白肋烟和烤烟烟叶产生的氮氧化物浓度差异明显，其中白肋烟产生的NO和NOx浓度极显著高于烤烟中的浓度（P＜0.01），约9倍，这可能与白肋烟样品的NO3-N含量较高有密切的关系。

表1 不同的烟叶类型对氮氧化物形成的影响Tab.1 Effect of tobacco types on the formation of nitrogen oxides in tobacco leaves under 50°C for 48 h

2.2 贮藏条件对白肋烟氮氧化物形成的影响

2.2.1 温度对白肋烟氮氧化物形成的影响

从图1可以看出，随着烟叶贮藏温度从10℃增加到50℃，干燥器内NO、NO2和NOx浓度均明显增加，指数方程能较好地拟合NO和NOx对贮藏温度的反应（R2大于0.97）。白肋烟在50℃处理48 h后，干燥器内NO的浓度达到3.28×10-6，为10℃处理的42倍。贮藏温度为10℃到30℃，NO2的浓度差异不显著，温度升高到40℃时，NO2的浓度开始明显增加。研究结果表明，高温条件有利于烟叶中NO等氮氧化物的形成。

图1 温度对白肋烟烟叶氮氧化物气体形成的影响Fig.1 Effect of temperature on the formation of nitrogen oxides in burley tobacco leaves

2.2.2 贮藏时间对白肋烟氮氧化物形成的影响

50℃条件下，密闭干燥器中的白肋烟叶经过不同的贮藏时间后各处理氮氧化物的浓度见图2。密闭的白肋烟样品经过50℃、2 h的处理后，干燥器内NOx可以达到0.2×10-6。随着贮藏时间的增长，烟叶样品产生的NO和NOx浓度逐渐升高，处理超过20 h后NO和NOx浓度迅速增加，采用二项式方程能较好地拟合氮氧化物浓度随着处理时间变化的关系（R2均大于0.9）。干燥器内NO2的浓度较低，贮藏时间多于24 h 后，NO2的浓度才显著提高（P＜0.05）。

图2 贮藏时间对白肋烟烟叶氮氧化物气体形成的影响Fig.2 Effect of storage time on the formation of nitrogen oxides in burley tobacco leaves under 50°C

2.2.3 烟叶含水率对白肋烟氮氧化物形成的影响

由表2可以看出，烟叶含水率从4.23%增加到6.20%，30℃处理24 h后，产生的NO和NOx 浓度有所降低。当烟叶含水率提高到11.03%和12.29%时，处理24 h后干燥器内NO、NO2和NOx 浓度明显增加，显著高于4.23%和6.20%处理（P＜0.05）。而含水率高于18.17%以后，烟叶产生的NO和NOx 浓度呈下降趋势，当烟叶含水率为20.53%时，干燥器中NOx的浓度与烟叶含水率4.23%和12.29%时相比分别降低了32%和57%，说明较高的含水率不利于烟叶中硝酸盐或亚硝酸盐产生NOx。

表2 白肋烟含水率对烟叶氮氧化物形成的影响Tab.2 Effect of moisture content on the formation of nitrogen oxides in burley tobacco under 30°C for 24 h

2.3 吸附材料对白肋烟氮氧化物形成的影响

将含水率13.4%的白肋烟烟叶与吸附材料隔离放置在真空干燥器中，置于30℃条件下处理48 h后，干燥器内NOx浓度为0.37×10-6（图3）。加入5 g纳米二氧化硅后，NOx气体的浓度显著降低（P＜0.05），说明纳米材料对烟叶产生的氮氧化物具有一定的吸附能力。当烟叶样品与2 g的活性炭隔离放置48 h后，干燥器中NO和NOx的浓度显著低于其它两个处理（P＜ 0.05），NOx降低到0.017×10-6，与对照相比降低了95%，处理间NO2的变化不显著。

图3 吸附材料对白肋烟氮氧化物形成的影响Fig.3 Effect of indirect addition of absorption material and tobacco on nitrogen oxides formation in a closed system from burley tobacco

3 讨论

试验结果表明，烟叶中产生的氮氧化物以NO为主，占90%以上，与卷烟烟气中的组成一致[6]。烟气中的NOx大部分来源于烟丝中的硝态氮（NO3-N）[5]，添加硝酸盐后卷烟烟气中NOx的释放量明显升高[19]。本试验白肋烟叶经50℃高温处理48 h后，干燥器内NO和NOx浓度为烤烟的9倍左右，这与白肋烟具有较高的NO3-N含量密切相关。本试验中选择的5个温度值（10℃、20℃、30℃、40℃、50℃）充分考虑了烟叶的实际贮藏条件，夏季气温略高于30℃，而烟叶贮藏温度可以高达45℃以上。将白肋烟样品置于不同处理温度下，烟叶产生的NO、NO2和NOx浓度均随着温度的升高而明显增加，50℃处理后NO的浓度与对照10℃相比增加了42倍，说明高温能够促进烟叶NOx的形成。为了更明显的观测贮藏时间对烟叶NOx形成的影响，我们将烟叶放置在50℃下贮藏，随着高温贮藏时间的延长，烟叶NOx浓度明显升高，说明处理过程中烟叶可以不断的产生氮氧化物。有关烟叶长期自然贮藏过程中氮氧化物的形成情况有待于进一步研究。

本研究中，为了更贴近烟叶实际贮藏温度，减少处理过程中烟叶含水率的损失，分别将含水率设定为高、中、低的3组烟叶在30℃处理24 h。结果表明，含水率20.53%的烟叶产生的NOx浓度最低，与TSNAs随含水率的变化规律基本吻合[20]。隔离加入活性炭和纳米二氧化硅后，烟叶产生的NO和NOx浓度显著下降（P＜0.05），其对TSNAs影响的研究正在进行中。

4 结论

相同的贮藏条件下，白肋烟叶产生的氮氧化物浓度显著高于烤烟。在10℃到50℃范围内，白肋烟样品产生NO和NO2的浓度随着贮藏温度的提高而明显增加；且随着高温贮藏时间的延长，烟叶产生NOx的浓度不断增加。烟叶含水率高于18%时可以抑制NOx的形成，加入活性炭可以降低烟叶周围的NOx浓度。

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E ff ect of storage environment on nitrogen oxides formation in leaves of tobacco of di ff erent types

WANG Jun1,ZHANG Mengyue1,SHI Hongzhi1,JIN Tong1,ZHOU Jun2,YANG Huijuan1,BAI Ruoshi2,ZHANG Chen2
1 National Tobacco Cultivation & Physiology & Biochemistry Research Center,Henan Agricultural University/Key Laboratory of Tobacco Cultivation / Tobacco Harm Reduction Research Center,Zhengzhou 450002,China;
2 Beijing Cigarette Factory,Shanghai Tobacco Group,Beijing 100024,China

In order to study the e ff ect of storage environment on nitrogen oxides(NOx)formation from tobacco leaves,content of NOx in airtight environment set up by vacuum desiccator was measured for di ff erent tobacco types,storage temperatures and duration at di ff erent moisture contents.Results showed that NO accounted for more than 90% of the NOx produced from tobacco leaves during storage.NOx concentration from burley tobacco leaves was almost 9 times higher than that from flue-cured tobacco under same storage conditions.As storage temperature increased from 10°C to 50°C,the concentration of NO and NO2produced from burley tobacco increased gradually 48h after treatment.NOx could be produced in burley tobacco samples in a short period of time(2h)under 50℃,and increased with increase of storage time.Under the same storage temperature,NO and NOx concentrations of tobacco leaves with moisture content higher than 18% were signi fi cantly lower than samples with moisture content of 11.03% and 12.29%.Presence of activated carbon in storage containers e ff ectively reduced the concentration of NOx.It was concluded that proper control of storage environment is an e ff ective way to reduce TSNA formation in tobacco leaves by inhibiting and reducing production of NOx from tobacco itself.

tobacco leaf; storage temperature; tobacco moisture content; nitrogen oxides

王俊，张梦玥，史宏志，等.烟草类型及贮藏环境对烟叶氮氧化物形成的影响[J].中国烟草学报，2017,23（5）

国家烟草专卖局减害重大专项项目：110201301022（JH-03）

王 俊（1985—），博士研究生，主要从事烟草栽培生理研究，Email：wangj921@163.com

史宏志（1963—），教授，博士生导师，主要从事烟草栽培生理研究，Email：shihongzhi88@163.com

2017-01-09；< class="emphasis_bold">网络出版日期：

日期：2017-10-13

：WANG Jun,ZHANG Mengyue,SHI Hongzhi,et al.E ff ect of storage environment on nitrogen oxides formation in leaves of tobacco of di ff erent types[J].Acta Tabacaria Sinica,2017,23(5)

*Corresponding author.Email：shihongzhi88@163.com