刺五加膏遗传毒性和致畸作用实验研究

肖佳音，王春雨，李庆忠

(黑龙江省食品药品检验检测所，黑龙江 哈尔滨 150088)

刺五加膏遗传毒性和致畸作用实验研究

肖佳音，王春雨，李庆忠*

(黑龙江省食品药品检验检测所，黑龙江 哈尔滨 150088)

目的：对刺五加膏进行遗传毒性及致畸作用评价，为其临床应用开发提供安全性试验依据。方法：采用小鼠睾丸染色体畸变试验、哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验、致畸试验来对刺五加膏进行评价。结果：当剂量为10.0、5.0、2.5 g/kg时，在小鼠睾丸染色体畸变试验中染色体结构畸变率分别为0.2%、0.4%、0%，早熟分离率分别为0%、0%、0.2%，互相异位率均为0%；哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验中染色体数目变化畸形率分别为0.3%、0.1%、0%，结构变化畸变率分别为0.8%、0.7%、0.7%。当剂量为7.5、3.75、1.875 g/kg时，致畸试验对孕鼠的体质量增长、孕鼠的胚胎毒性及对胎鼠生长发育、胎仔的内脏及骨骼均无明显异变。三项试验结果均与溶媒对照组接近，结果显示阴性。结论：在本实验条件和剂量下，刺五加膏未见遗传毒性作用及致畸作用。

刺五加膏；遗传毒性；致畸作用

刺五加[Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxin.)Hams]为多年生硬质灌木。具有补益肝肾，添精补髓，强壮筋骨之功效，用于缓解肝肾亏虚所致的暂时性脑缺血发作、脑动脉硬化及脑血栓形成,还可用于治疗冠心病、心绞痛兼有神经官能症及更年期综合征，对于应激导致的病理生理变化及炎症均有较好的疗效[1]。刺五加膏为刺五加经加工制成的浸膏，益气健脾，补肾安神，用于脾肾阳虚，体虚乏力，食欲不振，腰膝酸痛，失眠多梦。本实验通过对刺五加膏进行遗传毒性及致畸作用的研究，评价其遗传毒性，为其临床应用开发提供安全性试验依据。

1 材料和方法

1.1 样品

刺五加膏由黑龙江省食品药品检验检测所提供，为红褐色浸膏，规格为120 g/支，每次1.5 g，每日3次，阴凉干燥处保存。其人体推荐服用剂量为4.5 g/(60 kg·d)。本品为红褐色浸膏状物质，试验时以蒸馏水作为溶媒稀释后使用。

1.2 实验动物

清洁级KM种小鼠及Wistar大鼠由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，许可证号：SCXK(吉)2011-0004。饲料由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，许可证号：SCXK(吉)2010-0001。饲养环境为清洁级实验室，许可证号：SYXK(黑)2014004，温度(23±2)℃，湿度(55±10)%。

1.3 剂量选择与受试物给予方式

1.3.1 小鼠睾丸染色体畸变试验

采用经口灌胃方式给予受试物，设10.0、5.0、2.5 g/kg三个剂量组，另设溶媒对照组和环磷酰胺(40 mg/kg)阳性对照组，各组给药体积均为均为20 mL/kg。

1.3.2 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验

采用经口灌胃方式给予受试物，设10.0、5.0、2.5 g/kg三个剂量组，另设溶媒对照组和环磷酰胺(40 mg/kg)阳性对照组，各组灌胃量均为20 mL/kg。

1.3.3 致畸试验

灌胃给予受试物，分别设7.5 g/(kg·d) (高剂量组，相当于人体推荐量100倍)、3.75 g/(kg·d)(中剂量组，相当于人体推荐量的50倍)、1.875 g/(kg·d)(低剂量组，相当于人体推荐量的25倍)剂量组，另设溶媒对照组和环磷酰胺20 mg/(kg·d)阳性对照组，各组给药体积均为10 mL/kg。

1.4 主要仪器与试剂

1.4.1 仪器

生物显微镜(Olympus公司，BX53)；变焦体视显微镜(Olympus公司，SZX7)；离心机(Sigma公司，2-6)；电子天平(METTLER公司，AL204)；电子天平(德国sartorius公司，BSA2201)。

1.4.2 试剂

环磷酰胺(Sigma公司，批号120M1253V)；秋水仙素(aladdin Chemistry Co.Ltd，批号34723)；Giemsa染液(Sigma公司，批号BCBF9150)；氯化钠注射液(哈尔滨三联药业股份有限公司，批号110723A9)。

1.5 试验方法

1.5.1 小鼠睾丸染色体畸变试验[2]

取上述小鼠25只，按体质量随机分成5组，每组5只，分为受试样品高、中、低剂量组、溶媒对照组及阳性对照组。受试样品高、中、低剂量组分别灌胃给予刺五加膏10、5、2.5 g/kg，溶媒对照组灌胃给予等体积蒸馏水，灌胃体积20 mL/kg。阳性对照组腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg，注射体积20 mL/kg。各组均每天给药1次，连续5天。第一次给药后14天腹腔注射秋水仙素6 mg/kg，注射体积10 mL/kg，注射后6 h每组取5只存活小鼠颈椎脱臼处死，取双侧睾丸分离曲细精管，低渗、固定、制片、Giemsa 染色。每只动物分析100个中期分裂相的初级精母细胞，观察项目包括染色体结构改变(断裂、裂隙、微小体)、相互易位、X-Y和常染色体的单价体(早熟分离)。

1.5.2 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验[2-3]

取上述小鼠50只，雌雄各半，按性别、体质量随机分成5组，每组10只，分为受试样品高、中、低剂量组、溶媒对照组及阳性对照组。受试样品高、中、低剂量组分别灌胃给予刺五加膏10、5、2.5 g/kg，阳性对照组灌胃给予环磷酰胺40 mg/kg，溶媒对照组灌胃给予等体积蒸馏水，灌胃体积20 mL/kg。各组每天给药1次(间隔24 h)，连续给药4次，末次给药后24 h小鼠颈椎脱臼处死。处死前4 h腹腔注射秋水仙素4 mg/kg。处死小鼠后取股骨以2.2%柠檬酸钠溶液反复冲洗骨髓，离心、制片、Giemsa 染色，每只动物分析100个中期相细胞。观察项目包括染色体数目改变、染色体结构改变。

1.5.3 致畸试验[4]

将性成熟雌、雄大鼠按2∶1同笼过夜，每日早晨观察阴栓，查出阴栓认为该鼠已交配，当日作为“受孕”0天。如果5天内未交配，应更换雄鼠。检出的“孕鼠”分为5组，每组12只，分别为溶媒对照组给予等体积蒸馏水，低剂量组1.875 g/kg，中剂量组3.75 g/kg，高剂量组7.5 g/kg和阳性对照组环磷酰胺20 mg/kg。阳性对照组于孕期第11天一次性腹腔注射环磷酰胺10 mL/kg，其余各组于受孕的第7～16天，灌胃给药，给药体积10 mL/kg，溶媒对照组给予同体积的蒸馏水，受孕的0、7、12、16、20天称体质量。于大鼠受孕第20天直接断头处死。剖腹取出子宫称重，记录并检查吸收胎、死胎及活胎数。记录胎仔的性别、体质量、身长、检查胎鼠外观有无异常。每窝取一半胎仔用Bouin液固定，徒手切片法检查内脏，另一半胎仔用茜素红染色，检查骨骼。

1.6 数据统计及结果判定

按卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)规定，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，对各试验数据结果进行统计分析并判定试验结果。

2 结果

2.1 刺五加膏小鼠睾丸染色体畸变试验

表1可见，与溶媒对照组比较，刺五加膏高、中、低剂量组小鼠睾丸染色体畸变率差别均无统计学意义;阳性对照组小鼠睾丸染色体畸变率差别有统计学意义。

2.2 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验

表2可见，与溶媒对照组比较，刺五加膏高、中、低剂量组骨髓细胞染色体畸变率差别均无统计学意义;阳性对照组骨髓细胞染色体畸变率差别有统计学意义。

表1 小鼠睾丸染色体畸变试验结果

表2 最后一次给药后24 h小鼠骨髓细胞染色体畸变试验结果

2.3 致畸试验

由表3～6可知，刺五加膏各剂量组对孕鼠的体质量增长与溶媒对照组相比，差别无统计学意义(P>0.05)。对孕鼠的胚胎毒性及对胎鼠生长发育的影响，与溶媒对照组相比，差别亦无统计学意义(P>0.05)。胎仔的内脏及骨骼的检查结果表明，刺五加膏各剂量组对胎仔的内脏及骨骼均无明显异变，与溶媒对照组相比，差别无统计学意义。

表3 刺五加膏对孕鼠不同天数体质量增长的影响

注：与溶媒对照组比较，*P>0.05。

表4 刺五加膏对孕鼠体质量增重的影响

注：与溶媒对照组比较，*P>0.05。

表5 刺五加膏对孕鼠胚胎毒性的影响

注：与溶媒对照组比较，*P>0.05。

表6 刺五加膏对胎鼠生长发育的影响

注：与溶媒对照组比较，*P>0.05。

3 讨论

刺五加作为中药历史悠久,应用广泛，在历代本草均有记载，具有益气健脾、补益安神、益精壮骨之功效。《本草纲目》称刺五加为“本经上品”，能“补中益气，坚筋骨强意志，久服轻身耐老”。近年来研究表明，刺五加具有抗焦虑症的药理作用。刺五加膏以中医理论为指导，中药刺五加为原料，采用现代工艺加工而成，具有益气健脾，补肾安神之功，用于脾肾阳虚，体虚乏力，食欲不振，腰膝酸痛，失眠多梦。

本实验从小鼠睾丸染色体畸变试验、哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验、 致畸试验三项试验作为切入点，其目的是为安全性评价提供资料、降低使用风险。在三项试验中，刺五加膏高、中、低剂量组与溶媒对照组无差别，按照卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)进行评价，证实在本实验条件和剂量下，刺五加膏未见遗传毒性及致畸作用。

[1] 赵丹江.刺五加的药用价值[J].中医药信息,2011,28(5):115-117.

[2] 梁婕,张颖,俞萍,等.杨梅花青素的安全性评价研究[J].环境与健康杂志,2016,33(9):820-823.

[3] 齐彦,王瑶,郭丽新,等.桦菌芝多糖的抗突变作用研究[J].中医药信息,2011,28(1):21-23.

[4] 郭艳,兰真,曾凡骏,等.赶黄草的安全性毒理学评价研究[J].预防医学情报杂志,2016,32(5):476-481.

StudyonGeneticToxicityandTeratogenicityofAcanthopanaxSenticosus

XIAO Jia-yin, WANG Chun-yu, LI Qing-zhong*

(HeilongjiangInstituteforFoodandDrugControl,Harbin150088,China)

Objective:To study genetic toxicity and teratogenicity ofAcanthopanaxsenticosusand to provide safety testing basis for clinical application. Methods: This research adopted the mice testicle chromosome aberration test, bone marrow cell chromosome aberration test, and teratogenic test to evaluate genetic toxicity and teratogenicity of Acanthopanax senticosus ointment. Results: When the dose was 10.0, 5.0, 2.5 g/kg, the chromosome structure distortion rates were 0.2%, 0.4% and 0% respectively, premature separation rates were 0%, 0% and 0.2% respectively, ectopic rates were all 0%; Chromosome deformity were 0.3%, 0.1% and 0% respectively, in bone marrow cell chromosome aberration test, structural change aberration rates were 0.8%, 0.7% and 0.7% respectively. When the dose was 7.5, 3.75, 1.875 g/kg, teratogenic test showed that weight gain of pregnant rats, pregnant rat embryo toxicity, was the growth and development of fetal rats,and embryo of internal organs and bone were not aberrant.Conclusion: Under this experimental condition,Acanthopanaxsenticosusointment does not show genetic toxicity and teratogenicity.

Acanthopanaxsenticosusointment;Genetic toxicity;Teratogenication

R28

A

1002-2406(2017)06-0035-03

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(No. 12541259)

肖佳音(1978-)，女，博士，副主任药师，主要研究方向：药检药理，药品、保健食品及化妆品安全性评价。

李庆忠*(1962-)，男，主任药师，主要研究方向：药品、食品，医疗器械、药包材安全性评价。

2017-03-21

修回日期：2017-04-10