Box-Behnken设计-效应面法优化紫檀茋纳米混悬剂处方

陈哲，路娟，彭纪铭，2，柴瑞平，赵颖，王晓静，2，陈曦*

(1.中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193；2.山东中医药大学，山东 济南 250355)

质量工艺

Box-Behnken设计-效应面法优化紫檀茋纳米混悬剂处方

陈哲1，路娟1，彭纪铭1，2，柴瑞平1，赵颖1，王晓静1，2，陈曦1*

(1.中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193；2.山东中医药大学，山东 济南 250355)

目的：对紫檀茋纳米混悬剂的处方及制备工艺进行优化。方法：采用反溶剂沉淀法制备紫檀茋纳米混悬剂，以粒径、多分散系数(PDI)作为评价指标，采用Box-Behnken效应面法优化紫檀茋纳米混悬剂的处方，并对处方加以验证。 结果：通过软件对实验数据进行模型拟合，用响应面法预测最佳处方,所得处方为：紫檀茋的浓度为36 g/L，pluronic F68浓度 为2.2 g/L,牛磺胆酸钠的浓度为3.0 g/L。验证实验得到的紫檀茋纳米混悬剂粒径为(134.6±2.5)nm，PDI为(0.097±0.006)。体外溶出结果表明，紫檀茋的纳米化促进了其溶出速度。扫描电镜观察紫檀茋原料药及紫檀茋纳米混悬剂形态，可见紫檀茋纳米混悬剂呈类球状，且分布均匀。结论：Box-Behnken效应面法能够有效地优化紫檀茋纳米混悬剂处方，方法具有可行性。

Box-Behnken；效应面法；紫檀茋；纳米混悬剂

紫檀茋(Pterostilbene)是一种天然的非黄酮类多酚化合物，最早是在蓝莓中发现的，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤及抗缺血再灌注损伤的作用[1-3]。紫檀茋与白藜芦醇分子结构极其相似，互为同系衍生物，生物活性强于白藜芦醇[1]。但紫檀茋为脂溶性化合物，其水溶性差这一问题限制了其在临床上的应用。纳米技术是药物制剂领域一种比较成熟的技术[4],纳米混悬剂是纯的药物纳米粒子的胶态分散体系,该剂型不需要载体材料，通过表面活性剂稳定体系，使用简单的工艺和处方改善难溶性药物的生物利用度。Box-Behnken效应面法是一种优化试验条件的数学统计方法，传统的优化方法未考虑到试验的随机误差，而此方法对试验的随机误差也进行了考察。同时Box-Behnken效应面法建立了连续变量曲面模型，预测最佳方案，该方法科学合理，已被应用于各个领域[5-6]。本研究采用反溶剂沉淀法将紫檀茋制成纳米混悬剂，通过Box-Behnken效应面法对处方进行优化预测最佳处方。

1 试药和仪器

1.1 试药

紫檀茋购于上海毕得医药科技有限公司(批号0149449-131218000)；pluronic F68(绿叶生物，批号H25J7C9432)；牛磺胆酸钠(Beijing Biotopped Science & Technology，批号20160517)；无水乙醇(北京化工厂)；SDS(Japan，批号20140105506)；蒸馏水(屈臣氏)。

1.2 仪器

Nano-ZS纳米粒度及zeta电位分析仪(英国Malvern仪器公司)；Waters UPLC H-Class系统(含四元溶剂泵，自动进样装置，在线真空脱气装置，PDA检测器，Empower2色谱工作站)；JSM-6510扫描电子显微镜(日本电子株式会社)；KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；磁力搅拌器(Barnstead Thermolyne)；FJ300-SH型数显高速分散均质机(上海标本模型厂)；FD-1-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 制备方法

精密称定紫檀茋溶于5 ml无水乙醇，pluronic F68和牛磺胆酸钠溶于50 ml蒸馏水中，在3 000 r/min搅拌下缓慢滴加紫檀茋乙醇溶液，使其均匀分散在水相中，搅拌除去乙醇，制备得紫檀茋粗混悬剂。将粗混悬剂置于0℃冰水浴中，高速均质，即得纳米混悬液。

将得到的纳米混悬液加入8%的甘露醇做冻干保护剂，溶解搅拌均匀，放入-80℃冰箱预冻24 h后，取出放置预冷0.5 h的冷冻干燥机中，冻干48 h，取出，即得纳米混悬剂冻干粉。

2.2 单因素考察

2.2.1 均质剪切速度对粒径的影响

按“2.1”项下制备方法制备紫檀茋粗混悬剂，所得粗混悬剂分别在5 000 r/min，8 000 r/min，10 000 r/min，15 000 r/min，18 000 r/min均质2 min，用Nano-ZS纳米粒度及zeta电位分析仪测定平均粒径。根据实验结果显示选用18 000 r/min的剪切速度制备纳米混悬剂。结果见图1。

图1 均质速度对粒径的影响(n=3)

2.2.2 均质时间对粒径的影响

按“2.1”项下纳米混悬剂制备方法制备粗混悬剂，分别于18 000 r/min下均质,在1 min，2 min，3 min，4 min，5 min取样，用激光粒度分布仪测定平均粒径。由表1所示，可见均质2 min较均质1 min所得的纳米混悬剂粒径有明显减小，2 min后，纳米混悬剂的粒径变化较小，同时考虑到仪器使用注意事项要求实验室均质机连续工作时间要小于等于5 min，故选用均质时间为2 min。

表1 均质时间对粒径的影响(n=3)

2.2.3 乙醇用量对粒径的影响

分别将紫檀茋溶于1 ml，5 ml，10 ml无水乙醇中按“2.1”项下纳米混悬剂制备方法制备粗混悬剂，在18 000 r/min下均质2 min，得紫檀茋纳米混悬剂，用激光粒度分布仪测定平均粒径。由表2可知，乙醇用量越大，所得纳米混悬剂的粒径越小，综合各因素折中后选择5 ml无水乙醇溶解紫檀茋。

表2 乙醇用量对粒径的影响(n=3)

2.3 Box-Behnken效应面法处方优化

在预实验的基础上,以紫檀茋的浓度(X1)，pluronic F68浓度(X2)和牛磺胆酸钠的浓度(X3)为考察因素，以粒径、多分散系数为评价指标。采用Box-Behnken效应面法对以上3个影响因素进行进一步优化，Box-Behnken实验设计表及水平值见表3，实验结果见表4。

表3 Box-Behnken实验设计表及水平值

表4 Box-Behnken实验设计表及响应值

2.4 二次回归方程的建立

2.5 方差分析和显著性差异

表5 回归方程中系数的显著性检验

2.6 效应面分析与优化

使用Design-Expert8.05b软件，根据回归方程结果，选择X2设为中心点值，考察X1、X3对评价指标的影响，并做出曲面图(图2)。根据Box-Behnken响应面实验设计结果，对评价指标进行适当范围的限定，得到优化后的处方为X1=36 g/L，X2=2.2 g/L，X3=3.0 g/L。

图2 各因素对响应值影响的三维效应曲面图

2.7 验证实验

依据优化后处方制备3个平行紫檀茋纳米混悬剂，测定PDI(R1)和粒径(R2),结果见表6及图3。

表6 紫檀茋纳米混悬剂的实际值和预测值

图3 紫檀茋纳米混悬剂粒径分布图

2.8 HPLC 测定紫檀茋方法的建立

2.8.1 色谱条件

XSelect HSS T3(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相：乙腈-水梯度洗脱0～8 min，45%等度；8～9 min，45%～70%；9～15 min，70%乙腈等度；15～16 min，70%～45%乙腈；16～20 min，45%等度；流速:0.8 ml/min；检测波长：306 nm；柱温：25℃；进样量：10 μl。

2.8.2 对照品溶液的制备

精密称取紫檀茋对照品10.24 mg置于10 ml容量瓶中，甲醇溶解，定容至10 ml，混匀，即得紫檀茋对照品母液。

2.8.3 供试品溶液的制备

取紫檀茋纳米混悬剂冻干粉用蒸馏水溶解，精密量取1 ml加入透析袋中，以1%SDS磷酸盐缓冲液(PBS，pH值7.4)500 ml作为溶出介质，转速为100 rmp，温度为37℃。在45 min取1 ml溶出介质过0.22 μm的微孔滤膜，取续滤液即得供试品溶液。

2.8.4 专属性考察

按处方比例制备空白制剂，按供试品溶液制备方法制备空白溶液，取1 ml过0.22 μm的微孔滤膜，取续滤液进行高效液相色谱仪测定(色谱图见图4)。空白溶液与紫檀茋对照品未在同一保留时间出现色谱峰，可知空白辅料对紫檀茋的测定无干扰。

图4 对照品(A)、空白对照(B)和供试品(C)HPLC色谱图

2.8.5 线性关系考察

取“2.8.2”项下紫檀茋对照品母液，甲醇稀释成0.17，0.25，0.51，1.02，2.56，5.12，10.24，15.36，20.48，25.60，35.84，46.08 μg/ml的系列浓度梯度的对照品溶液，按“2.8.1”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，紫檀茋的质量浓度为横坐标(X)线性回归，得回归方程：Y=100 765X-41 146，r=0.999 6，结果表明紫檀茋在0.17～46.08 μg/ml范围内线性关系良好。

2.9 体外溶出测定

取紫檀茋纳米混悬剂冻干粉、紫檀茋与辅料的物理混合物、紫檀茋原料药适量用蒸馏水溶解(含紫檀茋约2 mg/ml)，精密量取1 ml加入透析袋中，以1%SDS磷酸盐缓冲液(PBS，pH值7.4)500 ml作为溶出介质，转速为100 rmp，温度为37℃。分别在5 min，10 min，15 min，30 min，45 min，1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h取1 ml溶出介质，同时补加相同体积的新鲜的溶出介质。将取出的溶出介质过0.22 μm的微孔滤膜，采用高效液相仪测定紫檀茋的浓度，计算累计溶出率。溶出曲线见图5。

图5 紫檀茋纳米混悬剂，紫檀茋原料药和物理混合物溶出曲线图

实验结果显示，纳米混悬剂的在2 h时累计溶出率已达到68%，而物理混合物和原料药均不到6%，8 h时纳米混悬剂的累计溶出率达到平台期。纳米混悬剂粒径较小，增大了药物的表面积，故溶出速率得到较大提高，溶出速率的提高也有利于药物在体内吸收，提高药物的生物利用度。

2.10 物理稳定性考察

采用“2.1”项下制备工艺制备纳米混悬液3个平行样品，每个样品分成两份分别放置于室温(25℃)和4℃保存7 d，观察并测定纳米混悬剂的粒径变化，见表7。

表7 紫檀茋纳米混悬剂物理稳定性考察表

结果显示，纳米混悬剂在4℃条件下较在室温放置下粒径变化较小，PDI值均有所增大，但依旧小于0.200，说明体系中的粒子有少量聚集现象。

2.11 形态观察

2.11.1 紫檀茋原料药形态观察

称取适量紫檀茋原料药，用蒸馏水分散后，滴一滴溶液至硅片上，使其均匀平铺，用滤纸吸取多余的液体，烘箱中30℃烘干后在扫面电镜下观察(图6a)。

图6 紫檀茋原料药(a)和紫檀茋纳米混悬剂(b)扫描电镜图

2.11.2 紫檀茋纳米混悬剂形态观察

取适量紫檀茋纳米混悬剂，将其稀释至适当浓度，滴一滴至硅片上，使其均匀平铺，用滤纸吸取多余液体，在烘箱中30℃烘干后在扫描电镜下观察(图6b)。

通过对比紫檀茋原料药与紫檀茋纳米混悬剂扫描电镜图看出，紫檀茋纳米混悬剂呈类球状粒子，表面较光滑，分布均匀，大小均一。

3 讨论

目前，难溶性药物的溶解度低的问题是药物在临床应用过程中的一个瓶颈，如何通过改良剂型提高难溶性的生物利用度是药剂学研究的关键点所在。纳米混悬剂是一种通过表面活性剂的稳定作用，将纳米级的药物颗粒均匀的分散在水中的稳定的胶态分散体系。由于其药物颗粒粒径小，且分布均匀大大增加了药物的溶解度，解决了难溶性药物在水中溶解度差的问题[7-9]。纳米混悬剂的制备最重要的是表面活性剂的选择和处方工艺的优化。

纳米混悬剂提高生物利用度的方式主要是由于纳米混悬剂粒子粒径小，比表面积大，这些特点使其对胃肠黏膜有更高的黏附性，促使药物在胃肠道中滞留时间增长，从而提高药物的生物利用度。另外，纳米混悬剂还可以通过改变粒子的粒径大小或者对其表面进行修饰起到靶向作用，目前脑靶向和肺靶向的药物已经比较成熟，达拉根纳米混悬剂用吐温-80和聚异丁基氰丙烯酸盐进行表面修饰，实现了脑靶向，用PEG对药物离子进行表面修饰后，可使在体内的循环时间延长，并在炎性部位富集[10]。

该实验首先考察了均质剪切速度，剪切时间，以及乙醇用量单因素对纳米混悬剂的粒径和PDI的影响，结果为剪切速度为18 000 r/min，剪切时间为2 min，乙醇用量为5 ml。紫檀茋的浓度(X1)，pluronic F68浓度(X2)和牛磺胆酸钠的浓度(X3)则采用Box-Behnken进行实验设计，结果用Box-Behnken实验软件进行分析，该试验方法与正交实验相比，更加全面地对处方进行优化，同时其可预测未做过的实验结果，这是Box-Behnken效应面法在药剂学中广泛应用的一个重要原因[11]。本实验通过该方法筛选出最佳处方及工艺，并加以验证，为进一步进行体内药代动力学的研究提供了研究基础。

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OptimizedtheFormulationofPterostilbeneNanosuspensionbyBox-BehnkenDesign-ResponseSurfaceMethodology

CHEN Zhe1, LU Juan1, PENG Ji-ming1,2, CHAI Rui-ping1, ZHAO Ying1, WANG Xiao-jing1,2, CHEN Xi1*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100193,China;2.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China)

Objective:To optimize the formulation and preparation technique of Pterostilbene nanosuspension. Methods:Pterostilbene nanosuspension was prepared by anti-solvent precipitation. Its formulation was testified and optimized by Box-Behnken design-response surface methodology, with average particle size and polydispersion index(PDI) as the indexes. Results:The model was fitted to the experimental data by software, and the best formulation was predicted by response surface method. The optimal formulation was as follows: the concentration of Pterostilbene, pluronic F68 and sodium cholytaurine were 36 g/L, 2.2 g/L, and 3.0 g/L respectively. The average particle size was(134.6±2.5)nm and PDI was(0.097±0.006). It showed that nanosuspension of Pterostilbene could improve its dissolution rate notably. Scanning electron microscope was used to observe the morphology of crude Pterostilbene and Pterostilbene nanosuspension, and Pterostilbene nanosuspension showed a near-spherical shape and evenly distributed. Conclusion:Box-Behnken design-response surface methodology can optimize the formulation of Pterostilbene nanosuspension effectively. The results proved the feasibility of this method.

Box-Behnken; Response surface methodology; Pterostilbene; Nanosuspension

R28

A

1002-2406(2017)06-0014-05

国家自然科学基金面上项目(No.81673667)；国家重大科技专项(No.2014ZX09201022-006)；云南省中青年学术带头人后备人才项目(No.2013HB099)；中国医学科学院医学与健康科技创新工程经费资助(No.2016-I2M-015)

陈哲(1991-)，女，硕士研究生在读，主要研究方向：中药药理。

陈曦*(1973-)，男，副研究员，主要研究方向：中药药理与毒理。

2016-12-29

修回日期：2017-01-15