清瘟败毒饮清热泻火组干预急性肺损伤的谱效关系研究

丁楠，高菁，陈丹阳，张旗，王晴，聂静，陈素娟，韩晶晶，张艳秋，冯超，李强

(北京中医药大学中药学院，北京 102488)

清瘟败毒饮清热泻火组干预急性肺损伤的谱效关系研究

丁楠，高菁，陈丹阳，张旗，王晴，聂静，陈素娟，韩晶晶，张艳秋，冯超，李强*

(北京中医药大学中药学院，北京 102488)

目的：明确清热泻火组干预大鼠急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的功效成分。方法：通过拆方配伍分析及多指标平行比较，选出清热泻火组进行功效成分研究。运用偏最小二乘回归法，将各提取物的HPLC图谱信息与其对应的药效学数据进行谱-效相关性分析，计算药效贡献率，筛选出贡献最大的功效成分。结果：各组提取物对ALI大鼠均有一定的干预作用，以50%乙醇提取物对蛋白浓度和肺湿干比干预作用最强。谱-效分析西红花苷-1药效贡献率最大。结论：西红花苷-1可能是清瘟败毒饮干预内毒素性ALI大鼠的功效成分。

清瘟败毒饮；西红花苷-1；急性肺损伤；谱效分析

中医学认为，ALI辨证属“温热癖毒”之证，应根据卫气营血阶段的不同进行治疗，早期应运用清热解毒方药急挫热势[1-4]。研究表明，清瘟败毒饮对LPS诱导的大鼠ALI有保护作用[5-8]，但中医复方成分复杂且药理作用具有多向性，究其干预ALI的药效成分及作用机理尚不清楚。本课题组前期已对清瘟败毒饮进行了拆方配伍分析，经多指标平行比较，本实验选择清瘟败毒饮的“最佳”拆方组-清热泻火组，并运用偏最小二乘回归分析法探究其液相图谱与药效之间的关系，以期筛选出清瘟败毒饮干预ALI的功效成分。

1 材料

北京同仁堂药店购买所需药材，经北京中医药大学刘春生教授鉴定；栀子苷对照品(纯度≥98%，批号110749-201316)、芒果苷对照品(纯度≥98%，批号111607-201503)、芦丁对照品(纯度≥98%，批号100080-201409)和西红花苷-1对照品(纯度≥98%，批号111588-201303)(中国食品药品检定研究院)；大肠杆菌内毒素(L2880，Sigma)；牛血清白蛋白(A7030，PH-7，Sigma)；地塞米松注射液(批号1507111)；考马斯亮蓝G-250(北京拜尔迪生物科技有限公司)。

清洁级雄性SD大鼠，体质量约200 g，合格证号为11400700036742，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

MK3型酶标仪(赛默飞仪器有限公司)；Effendorf5810R离心机(德国)；血液分析仪；Bx40F4型光学显微镜(OLYMPUS，日本)；AxioCam ERC5s成像系统(德国蔡司数码成像系统)；十万分之一电子分析天平(CAP225D Sartorius)；Waters 2698 高效液相色谱仪，2998/2489检测器。

流动相:乙腈和甲酸为色谱纯(美国Thermo Fisher)、水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取物制备

清热泻火组(生石膏30 g、知母15 g、竹叶15 g、栀子12 g)2份，分别用10倍量水、10%、30%、50%、70%、90% 乙醇回流提取3次，每次1 h，过滤，合并滤液，减压浓缩依次得到6组提取物(b1组、b2组、b3组、b4组、b5组、b6组)，含生药量约为0.72 g/ml。

2.2 HPLC图谱建立

2.2.1 条件

色谱柱Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温25℃；流速0.8 mL/min；进样量10 μL；检测波长246 nm；流动相A为0.1%甲酸水、B为乙腈，梯度洗脱: 0～5 min(5%～7% B),5～10 min(7%～7% B),10～20 min(7%～10.6% B), 20～36 min(10.6%～14.7% B), 36～43 min(14.7%～16% B),43～44 min(16%～20% B),44～79 min(20%～56% B),79～82 min(56%～60.6% B)。

2.2.2 供试品制备

精密量取各组提取物用不同浓度甲醇水稀释12.5倍，超声处理10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.2.3 对照品制备

分别精密称取栀子苷、芒果苷、西红花苷-1、芦丁对照品适量，分别用甲醇溶解定容，并过0.22 μm 微孔滤膜，即得对照品溶液。

2.2.4 样品测定

取各供试品10 μL，分别注入高效液相色谱仪，记录82 min色谱图，见图1，其中13、15、17和19号峰经标准品指认分别为栀子苷、芒果苷、芦丁和西红花苷-1，结果见图2。

图1 各组提取物的HPLC图

图2 提取物b4组的HPLC图及对照品HPLC图注:A.提取物b4组的HPLC图;B.芦丁对照品HPLC图;C.芒果苷对照品HPLC图;D.西红花苷-1对照品HPLC图;E.栀子苷对照品HPLC图。

2.3 药效实验

2.3.1 造模

大鼠适应性饲养5天，随机分9组：空白对照组(空白组)、模型组、地塞米松阳性组(阳性组)、给药组(分别为b1组、b2组、b3组、b4组、b5组、b6组)，每组9只。给药组：b1～b6组分别给予“2.1”项下提取的各组药液，每日1次，每次10 ml/kg，共计5天。造模前1 h，给药组再灌胃一次，阳性组注射地塞米松注射液2 mg/kg。

用水合氯醛(4 mg/kg)将大鼠麻醉，给药组、阳性组、模型组气管内滴注LPS(5 mg/kg)复制ALI模型, 空白组在相同条件下，气管内滴注等体积的生理盐水。造模12 h后，各组动物均取材。

2.3.2 指标检测

各组按造模时间，腹主动脉取血处死，剪开颈、胸部皮肤，行气管插管。右支气管结扎，用磷酸盐缓冲液(PBS)6 mL 分 3 次左肺充分灌洗，收集肺泡灌洗液(BALF)4.5 ml，离心(4℃,1 300 r,10 min)。取右肺上叶，计算湿干比(W/D)；取右肺下叶，苏木精-伊红(Hematoxylinand Eosin,HE)染色，光镜下观察病理组织，如图3；考马斯亮蓝法测定BALF中蛋白含量，结果见表2。

抑制率(%)=(1-各给药组/LPS组)×100%

与空白组相比，模型组中蛋白浓度及肺湿干比均显著升高(P<0.01)，造模成功。与模型组相比，各给药组及阳性组蛋白浓度及肺湿干比均明显下降(P<0.05)，以b4组蛋白浓度及肺湿干比抑制率最高。

2.3.3 病理形态学变化

2.3.3.1 肺部形态

空白组大鼠肺脏呈粉红色，表面光滑，体积正常，肺表面无暗红色出血点。模型组大鼠肺脏体积明显增大，伴暗红色出血点。阳性组及给药组大鼠肺脏体积增大情况及出血点情况较模型组均明显减轻，颜色偏暗或接近粉红色。

2.3.3.2 肺组织病理切片

空白组肺泡结构清晰，大小均匀，肺泡腔清晰，肺泡间隔正常，少量炎性细胞浸润。模型组部分肺泡腔内炎性细胞浸润，部分视野肺组织呈实变，肺泡间隔明显增厚，肺间质充血、水肿，表现特征性病理现象。给药组及阳性组LPS诱导的病理变化均有改善，说明该清热泻火组对LPS诱导的ALI有一定的干预作用，结果见图3。

图3 各组肺组织病理形态学观察( HE染色，×100)注：A.空白组;B.模型组;C.b1组;D. b2组;E. b3组;F. b4组;G.b5组;H.b6组;I.阳性组。

2.4 统计学处理

2.5 谱效相关性分析

本实验药效数据和液相图谱数据有着不同的度量标准，即量纲不同，所以采用标准差标准化，以消除变量量纲差异。经过标准化处理的特征图谱中代表化学成分各峰的峰面积积分值为自变量，标准化处理后的药效抑制率指标作为因变量，利用METALAB7.4.0统计软件，运用偏最小二乘回归法进行谱-效相关性分析，计算出各自变量对应因变量的回归系数。回归系数代表各自变量对因变量的贡献大小，以回归系数进行建模，即得回归方程。

以各提取物对蛋白的抑制率作为因变量得到回归方程：

Y1=(-0.174 2)X1+(-0.108 1)X2+0.172 4X3+0.061 4X4+0.057 4X5+(-0.058 2)X6+0.064 1X7+0.158 8X8+0.057 9X9+0.210 7X10+0.004 2X11+(-0.243 2)X12+0.098 8X13+0.003 9X14+

(-0.013 9)X15+(-0.158 4)X16+(-0.145)X17+(-0.030 7)X18+0.209 1X19、+0.086 7X20+0.005 8X21

以各提取物对肺湿干比的抑制率作为因变量得到回归方程：

Y2=(-0.148 5)X1+(-0.169)X2+0.094 4X3+(-0.11)X4+(-0.020 1)X5+(-0.325 2)X6+0.142 1X7+0.140 5X8+(-0.089 7)X9+0.144 4X10+0.142 1X11+(-0.156 1)X12+0.051 9X13+0.080 4X14+0.063 5X15+(-0.094 2)X16+(-0.178 9)X17+0.112 3X18+0.277 3X19+0.057 6X20+0.143 5X21

由上可知，回归方程是系i×Xi之和组成，由此看出X对药效Y 的贡献率取决于系数和峰面积两个因素，所以选取与Y 正相关(系数为正值) 的峰，并以所有(+)系i×Xi之和作为分母，以各个(+)系数i×Xi作为分子，得到自变量X 对药效Y 的贡献率。由药效指标可看出b4组对蛋白浓度和肺湿干比干预作用最强，对其各组分进行贡献率计算，结果见表3。

由贡献率可知，组分3，8，10，13，19对Y1的累积贡献率达71.34%，以组分10，19贡献最大，分别为17.69%，17.55%；组分7，8，10，11，19，21对Y2的累积贡献率达68.27%，以组分19贡献最大达19.12%。由“2.2.4” 项下的结果可知，峰13，19分别为栀子苷和西红花苷-1。结果提示，栀子苷和西红花苷-1可能具有抗内毒素性急性肺损伤活性。

表1 各提取物HPLC色谱峰的峰面积

表2 BALF中蛋白浓度及肺湿干比

表3 各提取物中各组分的药效贡献率

3 讨论

本实验首先采用全波长扫描检测，考察了238、246、258、300、440 nm 5个波长，发现246 nm下，样品各色谱峰分离较好，峰相对较多且响应值较高，故以246 nm为各样品的特征图谱检测波长。之后采用更为灵敏的双波长检测，分别对色谱柱、柱温、流速、进样量、流动相及洗脱条件进行了考察，并进行方法学考察，最终确定为“2.2.1”项下的色谱条件。

“清热泻火”组包括栀子、知母、石膏、竹叶4味药，栀子为清热泻火要药，且已有研究报道栀子苷对ALI具有干预作用[9]，但其余3味药及其相关化学成分还未见有关ALI的报道。故本实验通过多指标平行比较，选择了在各指标下表现均良好的“清热泻火”组。

本实验通过PLSR法，将复方干预大鼠ALI的药效与其特征图谱进行多元统计分析，获得可实现“药效还原”(与原中药效果相当)的功效成分组，并量化各成分对药效的贡献大小。除此之外，还采用多指标平行比较，将不同指标的药效与其特征图谱进行多元统计分析，可实现针对不同指标的功效成分组。PLSR法在最终模型中包含了原有所有自变量，既使数据信息得到最大限度地应用，又实现了回归建模(多元线性回归)、数据结构简化(主成分分析)以及两组变量之间的相关性分析(典型相关分析)[10]。该方法不仅阐明了中药可能的活性成分及各成分之间的协同、拮抗作用，通过药效量化，还能直观地反映出各活性成分与药效的关系。

本研究结果显示，“清热泻火”组不同提取物的药效作用有所不同，以50%乙醇提取物对ALI大鼠蛋白浓度和肺湿干比干预作用最强。谱-效相关性分析结果显示，“清热泻火”组中有15个成分与药效正相关，初步证明这些成分对ALI起协同作用。分析各正相关成分贡献率大小，可知西红花苷-1对蛋白浓度以及肺湿干比抑制作用均较强；由HPLC图谱信息可知，西红花苷-1在50%乙醇提取物中峰的响应值也相对其他组较高。由此可推测，西红花苷-1可能是清瘟败毒饮干预内毒素性ALI大鼠的功效成分。目前，西红花苷的药效作用研究主要集中在抗肿瘤、抗心脑血管疾病方面[11-12]，对其抗急性肺损伤的药理研究，值得进一步探究、开发。

[1] 吴玲,吕书勤.卫气营血辨证用于全身炎症反应综合征病情评估初探[J].中国中医急症,2010,19(1):74-83.

[2] 杨广,张敏州,郭立恒.从卫气营血辨证看全身炎症反应[J].时珍国医国药,2008,19(2):392-393.

[3] 黄建平.重症严重急性呼吸综合征的中西医结合救治思路[J].中国中西医结合急救杂志,2003,6(10):381-382.

[4] 曲妮妮.从卫气营血理论谈甲型H1N1流感的辨治思路[J].辽宁中医杂志,2010,37(3):453-454.

[5] 王非,何神娣,张长志,等.清瘟败毒饮对大鼠急性肺损伤保护作用的研究[J].中国中医药科技,2013,20(2):117-118.

[6] 何神地,骆仙芳,赵玮,等.清瘟败毒饮对内毒素性急性肺损伤大鼠血清细胞因子TNF-α、IL-8、IL-10表达的影响[J].中华中医药学刊,2011,29(9):2067-2070.

[7] 张长志.清瘟败毒饮对急性肺损伤大鼠肺组织核因子-κB表达的影响及其对肺的保护作用[D].杭州:浙江中医药大学,2010.

[8] 王非,张长志.清瘟败毒饮对急性肺损伤大鼠促炎症和抗炎症因子水平的影响[J].浙江中医药大学学报,2011,35(3):391-394.

[9] 王丽莎,梅妹.栀子苷对小鼠急性肺损伤保护机制的研究[J].中国农学通报,2012,28(23):26-31.

[10] 王园园,陈景武.偏最小二乘回归分析在医学中的正确应用[J].中国卫生统计,2010,27(2):208.

[11] Chen H,Detmer SA,Ewald AJ,et al.Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development[J].J Cell Biol,2003,160(2):189-200.

[12] Thushara RM,Hemshekhar M,Santhosh MS,et al.Crocin, a dietary additive protects platelets from oxidative stress induced apoptosis and inhibits platelet aggregation[J].Mol Cell Biochem,2013,373(1-2):73-83.

R285.5

A

1002-2406(2017)06-0023-04

“重大新药创制”科技重大专项-双黄连粉针剂技术改造(No.2011ZX09201-201-15)；北京中医药大学在读研究生自主选题项目(No.2016-JYB-XS119)

丁楠(1993-)，女，硕士研究生，主要从事中药药效物质基础及功效成分组研究工作。

李强*(1972-)，男，研究员，硕士研究生导师，主要从事中药药效物质基础及功效成分组研究工作。

2017-08-15

修回日期：2017-09-01