黄肿树JcFATA基因原核表达载体构建及表达体系优化

刘颖++刘国选++黄川腾++杨亚利++唐家年++周开源++林诗婉++高美芳++吴东霖++陈建平

摘要 植物脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶A（fatty acyl acyl carrier protien thioesterase，FATA）是脂肪酸积累过程中的关键酶，直接调控脂肪酸的含量与组成。目前有关黄肿树脂酰-ACP硫酯酶A基因（JcFATA）（GenBank登陆号：EU267122.2）的功能研究还未见报道。对JcFATA基因进行原核表达是研究JcFATA基因功能的一种重要手段，而开展这项研究的前提是构建原核表达载体。因此，本研究以黄肿树cDNA为模板克隆出JcFATA基因原核表达片段，将其连接到带有His标签的原核表达载体pCold I上，将所构建的重组载体pCold I-JcFATA转入大肠杆菌Rosseta。为了表达更多的可溶性His-JcFATA融合蛋白，本文还探讨了不同IPTG浓度（0.1、0.5、1.0 mmol/L）、不同诱导温度（15、25、37 ℃）和不同诱导时间（0、15、30 h）对蛋白表达的影响，诱导产物经超声波裂解破碎后，利用SDS-PAGE比较分析融合蛋白表达量，从而确定最佳的表达体系。结果表明，当添加诱导剂IPTG的浓度为0.5 mmol/L，诱导时间为15 h，培养温度为25 ℃时，可以获得较多的可溶性融合蛋白（His-JcFATA）。此外，进行蛋白纯化时发现，在镍柱上进行第5次洗脱时所获得纯化蛋白质量最佳。本研究的结果可为进一步研究JcFATA基因的功能奠定基础。

关键词 黄肿树；JcFATA基因；原核表达；蛋白纯化

中图分类号 S72；Q75；Q78 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）19-0136-04

Abstract The fatty acyl carrier protien thioesterase（FATA） is a key enzyme in the accumulation of fatty acids，which directly regulates the content and composition of fatty acids.The function of the acyl-ACP thioesterase A gene（GenBank accession number：EU267122.2） in Jatropha curcas has not been reported before.An important method to analyze the function of JcFATA gene is the prokaryotic expression，and the prerequisite of which is to construct prokaryotic expression vector.The JcFATA gene was cloned from J.curcas cDNA and inserted into the prokaryotic expression vector pCold I with His-tag.The recombinant vector pCold I-JcFATA was transformed into Escherichia coli Rosseta.In order to express more soluble fusion proteins His-JcFATA，different IPTG concentrations（0.1，0.5 and 1.0 mmol/L），different induction temperatures（15，25 and 37 ℃） and different induction times（0，15 and 30 h） were investigated on the protein expression.After the cells were disrupted by ultrasound，the expression of the fusion protein was analyzed by 12% SDS-PAGE to determine the optimal expression condition.The results showed that the soluble fusion protein（His-JcFATA） could be obtained better when the concentration of the inducer IPTG was 0.5 mmol/L，the induction time was 15 h，and the culture temperature was 25 ℃.In addition，the study also showed that the fifth elution for protein purification on the nickel column might obtain the best quality of purified protein.The results of this study can lay a foundation for the further analyzing functions of JcFATA gene.

Key words Jatropha curcas；JcFATA gene；prokaryotic expression；protein purification

黃肿树（Jatropha curcas）是大戟科（Euphorbiaceae）麻疯树属（Jatropha）多年生木本植物，也是世界公认的一种非常具有开发潜能的能源植物，其种子油被认为是生产“生物柴油”的优良原料[1-2]。目前，虽然黄肿树的种植面积还在不断扩大，同时基础研究也在逐渐深入，但还存在一些限制其产业化发展的问题，如种子油的总产量过低和油脂的质量不佳等[3-5]。Qu等[1]的研究结果表明，黄肿树中脂肪酸的含量和组成比例，可能会直接影响黄肿树种子油的质量和总含油量。而植物种子油的生成和脂肪酸的积累都是由相关功能基因来调控，如甘油-3-磷酸酰基转移酶（glycerol phosphate acyltransferase，GPAT）、ω-3脂肪酸去饱和酶（ω-3 fatty acid desaturase，FAD）、磷脂酶D（Phospholipase D，PLD）等，这些基因都参与油脂的合成，并在脂肪酸合成代谢中起重要的调节作用[6-8]。因此，为了培育高产优质黄肿树新品种，有必要对其脂肪酸积累相关功能基因进行研究。

植物脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶A（Fatty acyl acyl carrier protien thioesterase，FATA）是一类由细胞核基因编码的，主要是以二聚体的形式存在质体球蛋白，其主要功能可能是在脂肪酸合成代谢过程中催化酰基-ACP水解，对游离脂肪酸的释放起重要调控作用，直接影响脂肪酸的含量与组成[9-10]。目前，有关黄肿树JcFATA基因的功能研究还未见报道。对JcFATA基因进行原核表达是研究JcFATA基因功能的一种重要手段，为进一步分析黄肿树 JcFATA蛋白结构和功能的关系提供了试验基础，而开展这些研究的前提是构建原核表达载体并获取纯化的目的蛋白。因此，本研究拟从黄肿树中克隆JcFATA蛋白的编码基因，并构建JcFATA基因的原核表达载体，将其导入大肠杆菌中进行表达；为能诱导表达出较大量的可溶性蛋白，还将对表达和纯化体系进行优化，为进一步开展该基因的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与载体

大肠杆菌菌株（Escherichia coli）DH5α和Rosseta以及农杆菌菌株（Agrobacterium tumefaciens）EHA105由广东海洋大学农学院植物生物技术与分子生物学实验室保存。原核表达载体pCold Ⅰ载体（His标签），由华南农业大学生命科学学院实验室惠赠。

1.2 主要试剂

RNA抽提试剂盒购自Solar公司（美国），进行目的片段PCR扩增的高保真酶KOD-plus试剂盒购自TOYOBO公司（日本），总DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均购自TIANGEN公司（北京），普通Taq酶、各種限制性内切酶、T4 DNA连接酶、反转录试剂盒和Mighty Amp DNA polymarase试剂盒为TaKaRa公司产品（日本），PCR引物由广州捷瑞公司合成（广州），低分子量蛋白质Marker（14.4～97.4 kD）购自贝斯特公司（中国），其余常规试剂均为国产分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 总RNA提取及cDNA的合成。黄肿树总RNA提取采用Solar公司的RNA抽提试剂盒进行，具体操作步骤依据试剂盒说明书进行。从黄肿树幼嫩的叶片中提取总RNA，根据TaKaRa反转录试剂盒说明书将总RNA反转录为cDNA。

1.3.2 黄肿树JcFATA基因的克隆及回收。根据美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）所提供的黄肿树JcFATA基因序列（NCBI Genbank登陆号为EU267122.2，1 110 bp），用Primer 5.0软件设计特异引物，上游引物序列为F1：5′-AAAAGGATCCATGATGTTGAA GGTACCGTG-3′（划线处为BamH I酶切位点），下游引物序列为F2：5′-AAAACTGCAGTCATCTGGAGGGCTTCTTTC-3′（划线处为PstI酶切位点）。以黄肿树cDNA为模板，采用引物F1和F2进行PCR扩增。25 μL PCR扩增体系：2.5 μL 10×KOD Buffer、1 μL MgSO4（25 mmol/L）、2.5 μL dNTP（2 mmol/L）、引物F1/F2（10 μmol/L）各0.5 μL、0.5 μL KOD-plus酶（5 U/μL）、0.5 μL黄肿树cDNA和17 μL无菌去离子水。PCR反应程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，68 ℃ 1∶20 min，35个循环；最后68 ℃ 10 min，25 ℃ 1 min。采用DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带，-20 ℃保存回收产物。

1.3.3 JcFATA基因原核表达载体的构建。对pCold Ⅰ质粒和JcFATA基因分别用BamH Ⅰ和Pst Ⅰ进行双酶切，回收双酶切后的质粒和目的片段，用T4 DNA连接酶连接。将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，涂板培养后进行摇菌、双酶切鉴定（BamH Ⅰ和Pst Ⅰ）和菌液PCR鉴定。进行菌液PCR鉴定时以pCold Ⅰ质粒为阳性对照，水为阴性对照。PCR检测反应体系：采用15 μL反应体系，其中7.5 μL 2×Mighty Amp Buffer Ver.2、引物F1/F2（10 μmol/L）各0.2 μL、一点菌液为检测对象、0.2 μL Mighty Amp DNApolymarase和6.9 μL无菌去离子水。PCR检测反应程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 1：20 min，30个循环；最后68 ℃ 10 min，25 ℃ 1 min，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。将双酶切和菌液PCR检测均为阳性的克隆命名为pCold Ⅰ-JcFATA，最后对重组质粒进行测序，将测序正确的重组质粒转入大肠杆菌菌株Rosseta感受态细胞中，形成表达菌株pCold Ⅰ-JcFATA-Rosseta。

1.3.4 JcFATA基因原核表达。进行JcFATA基因原核表达主要参考Cheng等[11]报道的方法。将上述测序正确的重组质粒（pCold Ⅰ-JcFATA）转化大肠杆菌菌株Rosseta，在阳性克隆中挑取单菌落至3 mL含100 mg/L氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）的Lysogeny Broth（LB）液体培养基[12]中，恒温摇床上（37 ℃，200 r/min）振荡培养过夜；将200 μL过夜菌接种至20 mL含100 mg/L Amp的LB液体培养基中，恒温摇床上（37 ℃，200 r/min）振荡培至OD600=0.4～0.6，用含100 mg/L Amp的LB液体培养基调节菌液OD600=0.4，将菌液在冰上放置10～15 min，再分别对异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）浓度、诱导温度及诱导时间3种条件进行探讨，IPTG终浓度分别设定为0、0.1、0.5、1.0 mmol/L，诱导温度设定为15、25、37 ℃，诱导时间分别为0、15、30 h，最后取样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）电泳（具体方法见1.3.5），通过分析蛋白表达量确定最佳表达体系。

1.3.5 SDS-PAGE检测JcFATA蛋白的表达情况。利用SDS-PAGE检测JcFATA蛋白的表达情况主要参照Bi等[13]报道的方法。先将10% SDS-PAGE分离胶缓慢倒入胶板中，直至距离梳子约0.5 cm，凝胶约3 h后再将4% SDS-PAGE积层胶缓慢倒入胶板中，插入梳子，凝胶约1 h，即制成目的蛋白电泳检测所需的SDS-PAGE。将菌液转移到1.5 mL离心管，12 000 r/min离心2 min收集菌体，向其加入0.5 mL Lysis Buffer悬浮细胞，冰水浴中采用240 W超声波破碎3次，每次5 min，4 ℃ 12 000 r/min离心2 min，取上清液进行SDS-PAGE电泳。电泳完成后将凝胶取出，用双蒸水冲洗2～3次，然后在考马斯亮蓝R-250染色液中振荡染色2～3 h，用脱色液脱色2～3次，检测目的蛋白的表达情况。

1.3.6 可溶性蛋白的纯化。进行可溶性蛋白的纯化主要参照Zhu等[14]报道的方法。分别接种表达菌株和空白对照菌株于5 mL含100 mg/L Amp的LB液体培养基（种子液）中，37 ℃ 200 r/min振荡培养过夜，再将其接种至添加了0.5 mmol/L IPTG的100 mL上述液体培养基中，在培养温度为25 ℃的条件下，振荡培养15 h进行蛋白诱导，8 000 r/min离心5 min收集菌体，置于-20 ℃冷冻过夜，加入5 mL Lysis Buffer悬浮细胞，240 W超声波冰水浴破碎3次，每次5 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清液备用；取带有6×His标签的镍（Ni）纯化柱（康为世纪，北京）（30%乙醇保存），将其活化后置于4 ℃ 冰箱中进行预冷处理，向其加入上述上清液，4 ℃ 条件下缓慢摇动1 h，收集排出液F，再向Ni柱分2次分别加4 mL Wash Buffer，依次收集排出液W1和W2；再向Ni柱分7次分别加0.5 mL Elution Buffer，依次收集洗脱液E1、E2、E3、E4、E5、E6和E7。将上述收集液进行SDS-PAGE电泳分析，将经过电泳检测的纯化目的蛋白置于15 mL超滤离心管（截留分子量为30 KD），4 ℃ 3 000 r/min离心5 min，最后向浓缩后的目的蛋白中加入等体积30%甘油，混匀后，置于 -70 ℃保存。

2 结果与分析

2.1 JcFATA基因原核表达片段扩增

以黄肿树cDNA为模板，设计特异性的引物F1和F2进行PCR扩增，获得了JcFATA基因原核表达片段，經过凝胶电泳检测后发现扩增片段大小与预期符合（1 110 bp）（图1）。

2.2 JcFATA基因原核表达载体构建和转化

用BamHⅠ和PstⅠ将pCold Ⅰ质粒和JcFATA基因原核表达片段进行双酶切，接着将酶切后的目的片段和载体进行连接，然后转化大肠杆菌，经过平板筛选后，对阳性克隆进行培养并提取质粒，最后进行酶切检测（BamHⅠ和PstⅠ）（图2）和菌液PCR检测（图3），结果均显示片段大小与预期符合（1 110 bp）。将阳性克隆进一步测序检测，结果显示pCold Ⅰ-JcFATA载体已经构建成功。将测序完全准确地克隆转入大肠杆菌Rosseta感受态细胞，产生重组菌株pCold Ⅰ-JcFATA-Rosseta。

2.3 JcFATA基因原核表达体系优化体系优化

2.3.1 诱导时间和IPTG浓度对融合蛋白His-JcFATA诱导的影响。由于在预试验中重组pCold Ⅰ-JcFATA-Rosseta菌液在通常的表达体系中难以大量表达出可溶性蛋白，不利于后续蛋白分离和纯化，因而有必要对其原核表达体系进行优化。本研究在诱导温度都为25 ℃的条件下，分别对诱导时间和IPTG浓度进行了探讨，优化His-Tag融合蛋白His-JcFATA诱导表达体系。不同诱导体系的超声破碎产物上清液经SDS-PAGE电泳分析，从而确定最佳条件，试验结果如图4所示。

由图4可知，3种对照组CK0（未添加IPTG的pCold Ⅰ-JcFATA-Rosseta菌液）、CK1（添加0.5 mmol/L IPTG的pCold I-Rosseta菌液）和CK2（pCold Ⅰ-Rosseta菌液），经过诱导都不能表达目的蛋白，说明IPTG是诱导目的蛋白His-JcFATA表达所必需的，同时不含目的基因JcFATA的菌液即使添加IPTG也不能产生目的蛋白。

由图4还可知，在IPTG浓度相同条件下，诱导时间的不同，诱导产生的His-Tag融合蛋白His-JcFATA（约48 KD）的表达量也不同，当诱导时间为15 h时，可以获得最佳的诱导效果。在诱导时间相同的条件下，随着IPTG浓度的增加，诱导产生的融合蛋白的表达量也会改变，当IPTG浓度为0.5 mmol/L时，可以获得最佳的融合蛋白表达量。

2.3.2 诱导温度对His融合蛋白His-JcFATA诱导的影响。为了进一步优化His-Tag融合蛋白His-JcFATA诱导表达体系，本研究在诱导时间为15 h和添加0.5 mmol/L IPTG的条件下，对诱导温度进行了探讨，进一步优化His-Tag融合蛋白His-JcFATA诱导表达体系。不同诱导体系的超声破碎产物上清液经SDS-PAGE电泳分析，从而确定最佳条件。由图5可知，随着诱导温度的提高，目的蛋白的表达量也随之增加，当诱导温度为25 ℃时，可以获得最佳的诱导效果，而当诱导温度超过25 ℃时，诱导产生的His-Tag融合蛋白His-JcFATA表达量会有所减少。

2.4 His-Tag融合蛋白His-JcFATA纯化

His-Tag融合蛋白是目前最常见、最成熟的表达方式，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱法（Immobilized Metal-ion affinity chromatography，IMAC）来纯化[15-16]。

本研究对纯化体系进行优化，试验结果如图6所示。由图6可知，在进行蛋白纯化前，表达产物中有一些其他的蛋白成分（图6中的15 h和上清条带）；发现第3次洗脱（图6中的E3条带）时，可以获得最多的His-Tag融合蛋白His-JcFATA，而从第5次（图6中的E5条带）洗脱开始，可以获得较为纯净的目的蛋白。综上所述，收获目的蛋白最好是在第5次洗脱时开始收集。

3 讨论与结论

3.1 讨论

FATA是植物脂肪酸合成代谢中的关键酶，在游离脂肪酸的释放过程中起核心调控的作用，可能直接影响脂肪酸的含量与组成[1，9-10]。本研究通过基因重组技术获得了黄肿树JcFATA基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中成功表达了带His标签的JcFATA融合蛋白；此外，还建立了较好的蛋白纯化方法，获得了较高纯度的融合蛋白His-JcFATA。

诱导外源基因的原核表达受IPTG浓度、诱导时间和诱导温度等因素的影响[17]。首先，诱导温度的高低直接影响到蛋白表达成功与否，以及影响所表达蛋白的溶解性。前人的研究表明一般在37 ℃的温度下最有利于大肠杆菌的快速增长，蛋白表达速度最快，获得的蛋白量最大[18-20]。然而，本研究的结果显示25 ℃为最佳诱导温度，这可能是由于本次研究所使用的原核表达载体为pCold Ⅰ，该载体具有冷休克蛋白基因（Cold shock protein A，CSPA）启动子，该启动子功能强大，能在较低温度下高效的诱导目的基因表达；同时使用这种低温高效表达载体还可以有效减少由于高温条件下蛋白的快速合成从而导致形成较多的蛋白包涵体（包涵体不具有可溶性且蛋白的活性低）的现象发生。另外，IPTG浓度也会严重影响对蛋白的表达，IPTG浓度过高不利于大量目的蛋白的获得，这可能是由于IPTG本身对菌株有一定的毒性，因而过高的IPTG诱导浓度反而会抑制目的蛋白的表达。

pCold Ⅰ载体含有的His标签可作为纯化的标记，经诱导表达的重组蛋白经过带有His标签的镍柱时会被选择性吸附，再经过洗脱后就可以获得纯化的目的蛋白。由于His标签很小、不带电荷且没有免疫原性，因而它不会影响融合蛋白在细胞内的分泌和折叠，也不会对所纯化蛋白的结构与功能产生干扰作用[15-16]。

在蛋白纯化过程中，可能由于一些非特性蛋白与目的融合蛋白His-JcFATA竞争性的与His亲和介质结合，导致纯化的目的蛋白纯度不高。为了获得高纯度的His-JcFATA融合蛋白，本研究对蛋白的纯化条件进行了优化，结果表明，洗脱次数非常关键，洗脱次数太少，所获得的目的蛋白纯度不够，当洗脱次數达到5次时可获得较高纯度的融合蛋白His-JcFATA。本研究的结果为进一步分析JcFATA蛋白的结构与功能奠定研究基础。

3.2 结论

本研究将克隆的JcFATA基因表达片段插入到原核表达载体pCold Ⅰ中，将其转化大肠杆菌DH5α，经过氨苄青霉素抗性筛选、酶切检测和菌液PCR鉴定，确认成功构建了JcFATA基因原核表达载体（pCold Ⅰ-JcFATA），将pCold Ⅰ-JcFATA转入大肠杆菌Rosseta，形成pCold Ⅰ-JcFATA-Rosseta原核表达菌株，对其进行原核表达诱导并优化了表达体系（最佳诱导条件：IPTG浓度为0.5 mmol/L，诱导时间为15 h，培养温度为25 ℃）和纯化条件（洗脱次数达到5次），为进一步深入研究JcFATA基因和蛋白的功能奠定基础。

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