UPLC—MS/MS测定水产品中孔雀石绿残留量控制图的应用

倪建秀++陈涛++陈桂芳

摘要 通过优化前处理建立水产品中孔雀石绿残留量的UPLC-MS/MS测定方法，并应用控制图。样品经乙腈提取、固相萃取柱净化和浓缩，采用Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱，以乙腈-乙酸铵缓冲液（5 mmol/L）为流动相，在ESI正离子模式下检测。通过对36批次孔雀石绿和46批次无色孔雀石绿加标回收率测试，经过数理统计，绘制孔雀石绿和无色孔雀石绿的回收率质量控制图，得出孔雀石绿的行动限为71.8%～121.9%，警告限为80.2%～113.6%；无色孔雀石绿的行动限为79.5%～129.0%，警告限为87.8%～120.7%。结果表明，质量控制图能直观有效地反映UPLC-MS/MS法测定水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿的分析质量变化趋势，确保检测结果准确可靠。

关键词 优化；控制图；孔雀石绿；水产品；超高效液相色谱-串联质谱法

中图分类号 TS207.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）20-0240-04

Application of Control Chart in Determination of Malachite Green Residues in Aquatic Products by UPLC-MS/MS

NI Jian-xiu CHEN Tao CHEN Gui-fang

（Nanjing Agricultural Products Quality Inspection of Jiangsu Province，Nanjing Jiangsu 210036）

Abstract A detection method of malachite green residues in aquatic products was established by UPLC-MS/MS，through the optimization of pretreatment extraction methods，and control chart was used.The samples were extracted with acetonitrile，purified by a solid-phase extraction column and concentrated，separated by using Zorbax Eclipse Plus C18 column with acetonitrile-ammonium acetate buffer（5 mmol/L） as the mobile phase and ESI positive ion mode detection.Recoveries of standard addition were tested for 36 batches of malachite green and 46 batches of leucomalachite green samples， and then mathematical statistics were used to work out the quality control chart，the action limits of malachite green were 71.8%-121.9%，the warning limits were 80.2%-113.6%；the action limits of leucomalachite green were 79.5%-129.0%，the warning limits were 87.8%-120.7%.It was indicated that the quality control chart could directly and effectively control the determination of malachite green in aquatic products with UPLC-MS/MS，and ensure the accurate and reliable detection result.

Key words optimization；control chart；malachite green；aquatic product；UPLC-MS/MS

孔雀石绿（malachite green，MG）是一種三苯甲烷型绿色染料，曾因其廉价、高效的杀菌、杀寄生虫等性能而被用于水产养殖业，由于没有有效的替代品，孔雀石绿在水产养殖中的使用屡禁不止。孔雀石绿易被鱼体吸收并快速代谢为无色孔雀石绿（leucomalachite green，LMG），无色孔雀石绿亲脂性强，在水生生物体中残留时间长，故水生生物体中的孔雀石绿残留主要以无色孔雀石绿的形式存在，目前孔雀石绿及其代谢物检测主要采用液相色谱-质谱联用法（LC-MS）[1-4]、液相色谱-荧光法（HPLC-FLD）[5-6]、液相色谱-紫外法（HPLC-UVD）[7-8]等。液相色谱-串联质谱法前处理操作相对简易，并且可同时进行定性分析和定量分析，现被作为阳性样品的确证方法。

本文采用超高效液相色谱-串联质谱法测定孔雀石绿及其代谢物的回收率，对相关数据进行数理统计，制作出水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿回收率质量控制图，对检测系统实施有效内部质量控制，为准确检测孔雀石绿和无色孔雀石绿提供保障。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 6460C超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪（配有ESI离子源，Agilent公司）；Avanti J-E离心机（美国贝克曼公司）；数显型多管式漩涡混合器（美国Talboys公司）；BP211D电子天平，感量0.000 01 g（德国赛多利斯公司）；PL602E电子天平，感量0.01 g（瑞士梅特勒公司）；MV5全自动浓缩仪（美国莱伯泰科公司）；Synergy超纯水仪（德国默克密理博公司）；0.45 μm GHP万用膜针式过滤器（美国Pall公司）。endprint

孔雀石绿标准品，纯度98%（德国Dr.Ehrenstorfer公司）；无色孔雀石绿标准品，纯度98.5%（德国Dr.Ehrenstorfer公司）；同位素内标MG-D5，LMG-D6（WITEGA）；乙腈（色谱纯，Tedia公司）；5 mol/L乙酸铵（Sigma-aldrich公司）；中性氧化铝固相萃取小柱（1 g/3 mL，SUPELCO公司）。

准确称取适量的孔雀石绿及无色孔雀石绿标准品，用甲醇分別配制成100 μg/mL的标准贮备液，再用流动相稀释成相应的标准工作液。

试验中所采用的样品为淡水产品取可食部分。用多功能搅拌料理机打成匀浆，放置-20 ℃冰箱中冷冻贮存，将其在室温解冻后供前处理用。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理。称取5.00 g±0.02 g样品于50 mL离心管中，加入混合内标标准溶液，加入10 mL乙腈，涡旋提取5 min，以6 000 r/min离心5 min，上清液转移至另一离心管中，离心管再次加入10 mL乙腈，涡旋提取5 min，以6 000 r/min离心5 min，上清液合并至另一离心管中，移取10 mL样品溶液至用5 mL乙腈活化的中性氧化铝柱，收集全部流出液，45 ℃氮气吹至0.5 mL，用乙腈定容至1.0 mL，涡旋1 min，加入1.0 mL 5 mmol/L乙酸铵，涡旋1 min，样液经0.45 μm滤膜过滤。

1.2.2 色谱与质谱条件。①色谱条件。色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C18（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；流动相，A为水（含5 mmol/L乙酸铵），B为乙腈；A相梯度洗脱，0—4 min为40%—15% 4—10 min为15%—5%，10—12 min为 5%—40%；流速0.4 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL。②质谱条件。电喷雾离子源ESI为正离子模式；雾化气为氮气；离子喷雾电压4 000 V；干燥气温度350 ℃；干燥气流速11 L/min；雾化气压力0.31 MPa，扫描方式为多反应监测MRM。

2 结果与分析

2.1 样品提取、净化和浓缩方式的优化

《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（GB/T 19857—2005）[9]方法中需要加入提取液乙腈22 mL，定容至25 mL，而本方法加入乙腈20 mL，无需定容步骤，操作简单；GB/T 19857—2005方法中净化需要4 mL乙腈洗涤中性氧化铝柱，而本方法中无需该步骤，节约试剂用量；GB/T 19857—2005方法中用KD浓缩瓶接受固相萃取洗脱液，45 ℃旋转蒸发至约1 mL。

本方法中应用15 mL玻璃离心管接收固相萃取洗脱液，应用MV5全自动浓缩仪进行浓缩，相对于传统的旋转蒸发而言，具有溶剂挥发平稳、能同时浓缩54个样品、批量效率高、节约时间等优点（表1），又能保证结果的准确性、重复性（表2、3）。

2.2 质谱条件的优化

在电喷雾质谱、正离子监测模式下，分别对毛细管电压、碰撞能量和选择离子等进行优化，选取经碰撞后所得丰度较高的2个子离子作为定量和定性离子，并确定最佳碰撞能量的电压值。最终所选择的母离子、子离子和碰撞能量等参数见表4、图1～4。

2.3 线性范围、检出限及定量限

精确量取100 ng/mL孔雀石绿和无色孔雀石绿混合工作液适量，配制成质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、2.5、5.0、10.0、20.0 ng/mL的孔雀石绿标准工作液，内标浓度为10 ng/mL，以分析物的相对响应值（分析物与内标的峰面积比）为纵坐标，相对浓度（分析物与内标的浓度比）为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，孔雀石绿和无色孔雀石绿在0.5～20.0 ng/mL范围内具有良好的线性关系（图5、6）。

试验采用向空白中添加孔雀石绿的方法，依据定性、定量离子色谱峰的信噪比S/N≥3为检出限、S/N≥10为定量限，则该方法的检出限为0.2 μg/kg、定量限为0.5 μg/kg。

2.4 数据收集与处理

常使用孔雀石绿和无色孔雀石绿加标回收率试验作为常规测定的质量监控手段。每测定10个样品的同时检测空白样品和加标质控样品，计算回收率。共收集2015年3月至2017年3月期间的36组孔雀石绿和46组无色孔雀石绿质控数据，计算出36组孔雀石绿和46组无色孔雀石绿的回收率（表5、6）。以此为基础，计算回收率平均值X和标准差S，然后计算上下行动限X±3S、上下警告限X±2S和上下辅助限X±S[10]（表7、8）。

2.5 控制图的绘制

在Excel中录入表5～7的数据，绘制孔雀石绿和无色孔雀石绿回收率控制图，见图7、8。由图7可知，孔雀石绿回收率行动限范围为71.8%～121.9%，警告限为80.2%～113.6%。所有控制值均落在上下警告限范围内，各控制值数据是随机排列，没有连续7个控制值递增或递减，第7～16批次共计10个连续控制值落在中位线同一侧，属于方法受控但统计失控[10]，但大多数控制值离中位线较近，且16批次之后的控制值分布在中位线两侧，说明该控制图可以用于孔雀石绿测定的日常质量监控。由图8可知，无色孔雀石绿回收率行动限范围为79.5%～129.0%，警告限为87.8%～120.7%。所有控制值均落在警告限之内，属于方法受控[10]，说明该控制图可以用于无色孔雀石绿测定的日常质量监控。

3 结论与讨论

如控制值落在警告限之内，或控制值在警告限与行动限之间，但前2个控制值在警告限之内，则检验过程处于方法受控状态，可以报告分析结果。如果所有控制值落在警告限之内（最后3个控制值中最多有1个落在警告限和行动限之间），且连续7个控制值单调上升或下降，或连续11个控制值中有10个落在中位线的同一侧，则可以报告分析结果，但问题可能在发展。应尽早发现重要的变化趋势，以避免将来发生严重的问题。endprint

方法失控的判断原则[10]：控制值落在行动限之外，或控制值落在警告限和行动限之间，且前2个控制值中至少有1个落在警告限和行动限之间，在这种情况下，不得报告分析结果。所有在上一个受控的控制值之后分析的样品均应重新分析。失控后首先排除存在粗大误差，方法是在与分析该批样品完全相同的条件下，严格按照分析方法重新分析控制样品。如果新的控制值受控，可以认为前次分析未严格按分析方法进行，或者发生了粗大误差，可以重新分析整个分析批；如果新的控制值仍然失控但可重复，则说明极有可能存在系统误差。

为了检查孔雀石绿检测的系统误差，可以分析不同类型的能够监控分析程序正确度的控制样品，如标准溶液、至少含定量限浓度和高浓度的加标样品各1个、空白样品、对存留样品进行再检验检测、使用不同方法进行重复检验检测等。在检查确认存在系统误差的情况下，应逐个步骤进行检查以找出导致偏倚的原因，如变换乙腈等试剂、变换生产厂家或批次的固相萃取小柱、变换针式过滤器材质、变换设备和人员等。

控制图是在稳定状态下绘制的，如果出现操作人员更换、

设备更新和改变方法参数等情况，必须重新绘制。控制限和中位线应每年或每新增20个数据点后评估1次，在精密度或偏倚发生显著变化的情况下应考虑改变控制限。试验结果表明，采用LC-MS/MS法测定水产品中孔雀石绿残留量相对稳定，建议使用固定的控制限，根据1年以上且不少于60个控制值来计算标准偏差，这样可更真实地反映检测体系变化趋势，从而有效地监控检测系统，为实验室质量管理和控制提供依据，确保检测过程持续受控和检测结果准确可靠。

4 参考文献

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