大孔树脂联合聚酰胺法纯化牛蒡根总黄酮工艺的研究*

李 瑾，王 露，丁茂鹏，彭圆涛

陕西中医药大学 (咸阳 712046)

大孔树脂联合聚酰胺法纯化牛蒡根总黄酮工艺的研究*

李 瑾，王 露，丁茂鹏，彭圆涛

陕西中医药大学 (咸阳 712046)

目的：使用大孔树脂联合聚酰胺法进行牛蒡根总黄酮的纯化工艺研究。方法：将牛蒡根总黄酮的粗提物用大孔树脂和聚酰胺先后进行纯化。结果：用大孔树脂纯化黄酮时：用内径30 mm的层析柱以径长比1∶7装柱。将400 ml的上样液(浓度为10 mg/ml)，以0.5 BV/h的流速上样,用30%的乙醇以1.5 BV/h的流速进行洗脱(此时洗脱效果最佳)。聚酰胺纯化时用内径15 mm的层析柱以径长比1∶8装柱。用20 ml的上样液(浓度为1.5 mg/ml,PH为2)，以流速为0.5 BV/h上样,用70%乙醇以4 BV/h的流速进行洗脱(此时洗脱效果最佳)。结论：牛蒡根粗品总黄酮含量为7%，在最佳工艺条件下，经过大孔树脂纯化后，其总黄酮含量达到55.86%，再经过聚酰胺进一步纯化后，其总黄酮含量达到80.75%。

牛蒡根为桔梗目、菊科、牛蒡属植物牛蒡(Arctium lappa L.)干燥的根,有祛风热，消肿毒之功。牛蒡根中不仅富含蛋白质，糖类等营养成分[1]，还富含大量药效成分如有机酸类，多酚类，黄酮类等[2]。黄酮类是大多数中药都含有的成分，具有多种治疗功效，其具体的功效也因药物的不同而不同[3]。为了研究牛蒡根中黄酮的作用功效，需对牛蒡根的提取物进行分离纯化。目前研究牛蒡根有效成分提取工艺的较多，但研究有效成分纯化工艺的相对较少。有人[4]通过大孔树脂对不同条件下甘草总黄酮的静态与动态吸附与解析情况的研究，确定了大孔树脂纯化槲寄生总黄酮的最佳纯化工艺。有人[5]通过聚酰胺在不同条件下对枳实总黄酮的动态与静态吸附与解析情况的考察，确定了聚酰胺纯化枳实总黄酮的最佳工艺条件。

大孔树脂理化性质稳定是一种极性吸附剂，所以在分离纯化领域被广泛的应用。聚酰胺近年来也被广泛用于中药成分的分离纯化，尤其对于酚类，黄酮类的纯化效果极为显著[6-8]。聚酰胺分离纯化黄酮类成分，主要是利用黄酮类成分中的羟基易于与聚酰胺树脂结合成氢键，从而能有效地吸附黄酮类成分的特点将其分离纯化。目前，对与大孔树脂联合聚酰胺法纯化中药成分的方法鲜有报道，本实验采用将大孔树脂与聚酰胺树脂联合的方法对牛蒡根总黄酮进行了纯化，得到了相当不错的收率。该实验方法对于采用树脂纯化总黄酮类成分的研究具有重要意义，既提高了纯化过程中总黄酮的含量，又保证了纯化过程的经济效益，为牛蒡根总黄酮的进一步研究奠定了基础。

材料与方法

1 实验原料 牛蒡根:由陕西康盛堂中药饮片厂提供。

2 实验试剂 芦丁标准品(分析纯，上海永叶生物科技有限公司);大孔树脂(LS-46D，台州市路桥四甲生化塑料厂);聚酰胺树脂(分析纯，台州市路桥四甲生化塑料厂);无水乙醇(分析纯，上海瀚思化工有限公司)。

3 实验仪器 RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);UV2550型紫外可见分光光度仪(深圳市凯铭杰仪器设备有限公司)；FA2104N型电子分析天平(济南普纳仪器设备有限公司)。

4 牛蒡根粗品的制备[9-10]取经粉碎过筛后的牛蒡根粗粉20 g，加入60%乙醇160 ml，浸泡30 min后在85℃下回流提取40 min，重复3次，合并滤液，抽滤，将滤液浓缩至15 ml，石油醚脱脂，干燥。

5 牛蒡根总黄酮含量的测定[11]

5.1 标准曲线的绘制:取超声溶于60%乙醇中的芦丁标准品5.0 mg，定容至25 ml。液体配液按下表进行。移入标准品后再分别移入60%乙醇至5 ml。分别移入NaNO20.3 ml，反应6 min后分别移入Al(NO3)30.3 ml,反应6 min后移入氢氧化钠反应15 min，最后移入60%乙醇0.4 ml，用手摇均匀，然后在波长为510 nm测物质吸光度并绘制其标准曲线。

求得线性回归方程Y=6.1342X-0.00607，R2=0.99979，线性关系良好。

5.2 总黄酮含量的测定:把纯化后的牛蒡根黄酮样品精密称取5.0 mg，超声溶解，然后在25 ml容量瓶中定容,按以上配液方法配液，测出吸光度，用线性回归曲线求得样品浓度来计算牛蒡根总黄酮的含量。

6 大孔树脂的初步纯化

6.1 大孔树脂的选择[12]：分别称取大孔树脂NKA-9、AB-8、D101、LS-46D 各4 g于四个烧杯中，分别加入牛蒡根总黄酮粗品溶液(浓度为10 mg/ml，体积为400 ml)，于温度恒定的情况下振荡4 h，每间隔1 h取一样品并分别测其吸光度值，并算得吸附量。待上述吸附完成后，过滤除去残留液，加入30%乙醇50 ml，温度恒定的情况下振荡4 h，测总黄酮的含量，算得解析率，并在相同的条件下测其在60%，90%乙醇中的解析率。

6.2 纯化工艺的优化[13]

6.2.1 径长比对纯化效果的影响:把经过处理过的大孔树脂湿法装柱在内径为3 cm的层析柱中，使其径长比分别为1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10，制得6份牛蒡根粗品溶液，体积为400 ml,浓度为10 mg/ml，上样的流速为0.5 BV/h，洗脱的流速为1.5 BV/h。

在一定范围内径长比越大，黄酮含量越高，超过一定范围黄酮含量下降，实验表明在径长比为1∶8时黄酮含量最大，因此装柱径长比为1∶8较合适。

表1 大孔吸附树脂静态吸附(mg/g)

表2 大孔吸附树脂静态解析率

由表1中数据可知LS-46D静态吸附率最高可达315.37 mg/g，表2数据显示其静态解析率最高可达86.87%，在这四种树脂中均为最高，因此LS-46D为优选树脂。

6.2.2 上样量对泄露率的影响:取牛蒡根黄酮粗品放入烧杯中，配成10 mg/ml的上样液，进行上样，上样流速为以0.5 BV/h。每上100 ml上样液取一次样测其黄酮含量，并计算泄漏率。

当上样量越大，泄漏率呈不同程度增长，当超过400 ml时，泄漏率超过10%，并且增长速度加快，因此确定最佳上样量为400 ml。

6.2.3 上样流速对泄漏率的影响:配制牛蒡根总黄酮粗品溶液5份，浓度为10 mg/ml，分别控制上样流速为0.25 BV/h、0.5 BV/h、0.75 BV/h、1.0 BV/h，以0.5 BV/h流速洗脱。

上样流速和泄露率呈线性关系，当上样流速超过0.5 BV/h时，泄漏率超过10%。因此以0.5 BV/h流速上样效果最佳。

6.2.4 洗脱剂浓度和纯化效果的影响关系: 用不同浓度的乙醇(15%、30%、45%、60%、75%)洗脱牛蒡根总黄酮粗品溶液(10 mg/ml)5份，以，结果如图1所示。 由图可见，洗脱效果最佳点在用30%乙醇洗脱时，此时总黄酮含量最高。

6.2.5 洗脱流速对纯化效果的影响:取5份已经配好的牛蒡根总黄酮粗品溶液，流速都控制在0.5 BV/h，上样，以不同的流速0.5 BV/h、1.0 BV/h、1.5 BV/h、2.0 BV/h、2.5 BV/h洗脱，测其吸光度，算得解析率结果如下图2所示。

由图可知，流速控制在1.5 BV/h时比较合适，因为在1.5 BV/h流速洗脱解析率最高。

7 聚酰胺树脂的二次纯化

7.1 聚酰胺的活化及再生：聚酰胺的活化步骤为，取新聚酰胺树脂用无水乙醇处置后，用水洗到没有醇味，抽干备用。

聚酰胺的再生：先用5%NaOH将用过的聚酰胺树脂洗至无色，然后再用5%NaOH浸泡3 d，水洗至PH为7。

7.2 上样液的配制：取经纯化过的，浓度为55.86%的牛蒡根黄酮30 mg,配成20 ml 1.5 mg/ml的溶液，并调节PH为2。

7.3 聚酰胺树脂精选工艺的优化

7.3.1 泄漏曲线的绘制:取纯化过的牛蒡根黄酮适量，配成浓度为1.5 mg/ml的溶液，调节pH=2，以1.5 BV/h流速上样，从10 ml开始，每5 ml收集一次，测牛蒡根总黄酮的含量，绘制泄露曲线。

当上样量大于20 ml时，泄漏率超过10%，此时吸附的经初步纯化过的黄酮的量为30 mg。相当于每毫升聚酰胺树脂吸附1.42 mg。

7.3.2 上样液pH的优化:取经大孔树脂纯化过的牛蒡根黄酮，配成20 ml 1.5 mg/ml的上样液5份，调节pH使分别为1、2、3、4、5，以1.5 BV/h流速上样，用70%乙醇以4 BV/h的流速洗脱。洗脱结果如图3所示。由图可知，pH最好控制在2，因为当pH=2时洗脱效果最好。

7.3.3 上样浓度的优化:取纯化过的牛蒡根黄酮，配制20 ml成浓度分别为1.0 mg/ml、1.25 mg/ml、1.5 mg/ml、1.75 mg/ml、2.0 mg/ml的上样液5份，使pH=2，以1.5 BV/h的流速上样。上样浓度最好控制为1.5 mg/ml较好，否则会出现堵塞情况。

7.3.4 洗脱剂浓度的优化:取经大孔树脂纯化过的牛蒡根黄酮30 mg，配成8份浓度为1.5 mg/ml，体积为20 ml 的上样液,调节PH=2，以1.5 BV/h上样，分别用不同浓度的乙醇以4 BV/h洗脱，控制乙醇浓度梯度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。用70%乙醇洗脱洗脱效果最佳，因为此时总黄酮含量最高。

7.3.5 洗脱流速的优化:取经大孔树脂纯化过的牛蒡根黄酮30 mg配成1.5 mg/ml的上样液4份，并调节PH为2，以1.5 BV/h流速上样,分别以3 BV/h、4 BV/h、5 BV/h、6 BV/h流速进行洗脱，计算解析率并测吸光度，结果如图4所示。如图以4 BV/h流速洗脱为宜。

讨 论

本实验先采用大孔树脂将牛蒡根总黄酮进行了纯化，当以最优工艺纯化总黄酮含量7%的牛蒡根粗品时可使总黄酮浓度达到55.86%。用大孔树脂LS-46D以1∶8的径长比装住，以0.5 BV/h的流速上样,用30%乙醇以1.5 BV/h的流速洗脱时纯化工艺最优。接下来用聚酰胺对牛蒡根黄酮进行了二次纯化。当用最佳工艺条件纯化牛蒡根黄酮可使总黄酮纯度达到88.75%，纯化效果明显。当以体积，浓度，流速分别为20 ml，1.5 mg/ml,1.5 BV/h上样，用70%乙醇以4 BV/h流速洗脱时的工艺为最优工艺。

在中药制药工业中，大孔吸附树脂和聚酰胺树脂联合纯化是有发展前景的实用新技术之一，纯化工艺主要采用静态纯化和动态纯化结合聚酰胺树脂纯化，相较于单纯使用聚酰胺树脂，具有富集效率高、成本低、实用性强、易操作等特点。

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Purificationoftotalflavonoidsfromburdockrootsbymacroporousresincombinedwiththemethodofpolyamide

Wang Lu,Li Jin,Ding Maopeng,et al.

Shaanxi University of Chinese Medicine(Xianyang 712046)

Objective:To study the process of the Purification of total flavonoids from burdock roots.Methods: The crude extracts of the total flavonoids of burdock roots were purified by macroporous resin and polyamide.Results: The purification of flavonoids by macroporous resin: the folding layer column having an inner diameter of 30 mm was repleted with a diameter ratio of 1∶7. The effect of elution was optimum when the sample liquid of 400 ml, at the concentration of 10 mg/ml was loaded with flow rate of 0.5 BV/h and elute with a flow rate of 1.5 BV/h with 30% ethanol. The purification of polyamide: the folding layer column of 15mm having an inner diameter was repleted with a diameter ratio of 1∶ 8. The effect of elution was optimum when the 20 ml of the sample liquid, at the concentration of 1.5 mg / ml, PH 2, was loaded at the flow rate of 0.5BV / h and elute with 70% ethanol at the flow rate of 4 BV / h.Conclusion: The content of total flavonoids in burdock roots is 7%. Under the optimum conditions, the content of total flavonoids is 55.86% after purification through macroporous resin, and the total flavonoid content reaches 80.75% after further purification of polyamide.

Arctium lappa Flavones Pharmaceutical technology (TCD)

*陕西省教育厅科研基金资助项目(15JK1208)

牛蒡 黄酮 中药制药工艺

R284

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.11.055

(收稿：2017-07-13)