竹沥对慢阻肺大鼠肺组织中AQP1、AQP4、AQP5、TNF-α和IL-6的影响*

罗建江，马红霞

新疆医科大学附属中医医院(乌鲁木齐 830000)

竹沥对慢阻肺大鼠肺组织中AQP1、AQP4、AQP5、TNF-α和IL-6的影响*

罗建江，马红霞△

新疆医科大学附属中医医院(乌鲁木齐 830000)

目的：观察中药竹沥对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺组织中水通道蛋白1(AQP1)、4(AQP4)、5(AQP5)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6)表达的影响，探讨中药竹沥对慢性阻塞性肺病患者化痰疗效的可能机制。方法：选用雄性Wistar大鼠30只，适应性饲养1周后随机分为空白组、模型组、干预组,每组10只，除空白组外，其他组均采用香烟熏结合弹性蛋白酶气管滴入法复制COPD大鼠模型，90 d后，干预组进行鲜竹沥口服液灌胃10 d，余两组进行生理盐水灌胃10 d。干预结束后采用PCR法观察AQP1、AQP4、AQP5的表达，酶联免疫吸附法(ELISA)测定大鼠肺组织中TNF-α和IL-6的含量。结果：与空白组比较，模型组、干预组肺组织中AQP1、AQP4、AQP5浓度显著下降(P<0.01)，TNF-α、IL-6浓度显著升高(P<0.01)。与模型组比较，干预组肺组织AQP1、AQP5浓度显著升高(P<0.01)，AQP4、TNF-α和IL-6浓度显著下降(P<0.01)，差异均有显著统计学意义。结论：竹沥对COPD的疗效可能与调节水通道蛋白1、5(AQP1)、(AQP5)的转运，抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6)表达密切相关。

“庞大容量的肺”是对慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的最早描述，目前已经认识到气道和肺组织对有害气体或颗粒的异常炎症反应被认为是其重要特征[1]。其发病率高，对患者的活动能力、生活质量构成严重危害[2]。气道粘液的高分泌是COPD患者气道阻塞的主要原因，也是影响病情和预后评估的独立危险因素[3]，本文通过对大鼠造模，中药竹沥进行干预，对肺组织中水通道蛋白1(AQP1)、水通道蛋白4(AQP4)、水通道蛋白5(AQP5)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)进行观察，探索竹沥对COPD临床疗效的作用机制，报道如下。

材料与方法

1 动 物 SPF级雄性Wistar成年大鼠30只，鼠龄8周，体质量200 g±50 g，由新疆医科大学实验动物中心提供。

2 药物与剂量 鲜竹沥口服液 (成分：鲜竹沥，国药准字：Z35020128)根据体重按体表面积换算200 g加减50 g大鼠的每日灌药量为6.6 ml，分早晚两次灌胃。

3 试剂与仪器 电子天平由中国上海天平仪器厂生产，-80 ℃低温冰箱由德国 Thermo公司生产高速台式离心机由德国Eppendorf公司生产，Milli-Q型纯水系统由美国 Millipore公司生产，Elisa试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司(Rat IL-6 ELISA Kit No23035347 IL-6单位ng/L)

4 实验分组及造模给药 将30只大鼠适应性饲养1周后随机分为三组，每组10只，即慢性阻塞性肺病模型组、慢性阻塞性肺病模型干预组和空白对照组。具体干预措施为：模型组和干预组在开始实验后的第30天以0.8 ml/100 g的生理盐水气管滴注溶20 U弹性蛋白酶，并于第1天至第29天、第31天至第90天内每天上下午进行熏烟，每次10只大鼠持续1 h。在90 d熏烟后模型组和干预组分别进行生理盐水和鲜竹沥口服液灌胃10 d。空白组于第30天采用与模型组同样的方式在气管内进行等体积生理盐水的滴注，90 d后进行生理盐水灌胃10 d。

造模成功的表现为：大鼠肺部组织颜色呈白色或灰白色，外观体积增大膨胀，镜下可见支气管的管腔狭窄，黏膜充血水肿变形或异常增厚，杯状细胞化明显，大量炎性细胞聚集浸润。呼吸性细支气管管壁增生、肺泡膨大。细支气管远端的气囊腔不断膨胀，最终破裂并融合成大的气腔，因为回缩力降低，从而导致弹力纤维网破坏[4]。

5 指标检测 麻醉实验大鼠取血的同时，开胸暴露胸腔，结扎右肺，切除后上中叶迅速放入-80 ℃冰箱，用PCR法对肺组织中AQP1、AQP4、AQP5进行检测。下叶采用ELISA法分别对IL-6、TNF-α的浓度分别进行测定，实验具体步骤按照试剂盒内的说明书进行操作。

6 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件。所有数据用均数±标准差表示，并对相关实验数据行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

样本缺失说明：气道滴注弹性蛋白酶进行染毒过程中空白组死亡3只大鼠，染毒后熏烟造模过程中模型组、干预组各组死亡3只大鼠，有效样本量21只，TNF-α、IL-6测试中采用单鼠双肺测定，有效样本量为24只。

1 实验各组对模型大鼠肺部组织中AQP1、AQP4、AQP5表达高低的影响 表1结果显示：与空白组比较，模型组与干预组AQP1、AQP4、AQP5含量显著下降(P<0.01)；与模型组比较，干预组AQP1、AQP5显著升高，AQP4显著降低(P<0.01)。

表1 各组对大鼠肺组织中AQP1、AQP4、AQP5表达的影响

注：与空白组比较，△P<0.01；与模型组比较， *P<0.01

2 各组对大鼠肺组织中TNF-α、IL-6的影响 表2结果显示：与空白组比较，模型组与干预组TNF-α、IL-6显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，干预组TNF-α、IL-6显著下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。

表2 各组对大鼠肺组织中TNF-α、IL-6的影响

注：与空白组比较，△P<0.01；与模型组比较， *P<0.01

讨 论

竹沥，又名竹汁、淡竹沥等，始载于东汉的《神农本草经》。自古有“痰家之圣剂”之美称。常用于治疗肺热痰壅、咳嗽、大热烦渴，惊风等疾病，古籍中一些经典方剂如“竹沥达痰丸”、“竹沥枳术丸”、“黄柏竹沥膏”等均有对竹沥的应用记载。

慢性阻塞性肺病作为肺部损伤的常见慢性疾病，目前西医多用抗感染、解痉平喘等手段治疗，但效果并不理想，结合中医辨证论治无论是疾病的稳定期还是急性加重期都会提高COPD疗效，改善肺功能[5-6]。中药竹沥可抑制痰液的分泌、减轻气道的炎症反应，广泛用于各类呼吸道、肺部感染所致的咳嗽、咳痰、胸闷气憋[7]，有研究表明[8]西医基础治疗联合鲜竹沥口服可增加COPD急性发作期疗效，舒利迭联合鲜竹沥对治疗稳定期COPD患者安全有效，不仅能改善患者肺功能、同时还能减少激素吸入次数。其机制认为可能与竹沥含有大量巯基，可使分泌物中黏蛋白、糖蛋白的二硫键断裂，起到稀释痰液粘稠度，促进纤维摆动等作用，其次与竹沥中含丰富硒元素，可清除氧自由基，稳定细胞膜等因素有关[9]。

水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)作为细胞膜转运蛋白，在目前已发现的13种AQP中，有六种表达于肺，其中AQP1、AQP4、AQP5在肺水转运过程中有重要作用。有研究表明，AQP5基因敲除后可减弱肺部对细菌的清除能力，COPD患者中AQP4表达减少可导致其肺功能下降及气道炎症加重[10]。TNF-α、IL-6是机体内两种重要的多功能细胞因子，具有广泛的生物学活性，可促进肺部炎症细胞的募集，包括COPD、哮喘在内的慢性气道炎症性疾病，其急性加重期均有TNF-α、IL-6的参与[11]。

本研究对小鼠造模干预后发现：与空白组大鼠比较，模型组大鼠肺组织APQ1、APQ4、APQ5含量明显下降， IL-6 及TNF-α含量明显升高，表明在香烟烟雾及弹性蛋白的诱导下，肺内水液转运功能下降，运行失调，使水液储留于气道。与模型组比较，干预组可显著增强肺组织中AQP1、AQP5的表达，降低TNF-α、IL-6的表达，这与方志全[12]等研究相一致，提示竹沥可增强肺组织中水通道蛋白表达，以AQP1、AQP5为主，同时减轻炎性因子TNF-α、IL-6浸润，减少气道和肺粘液高分泌，缓解COPD患者痰液堵塞的状况，其机制可能还与粘蛋白如MUC5AC，MUC5BC、以及其它水通道蛋白的表达有关，需进一步研究论证。

[1] Kim V，Criner G.Chronic bronchitis and chronic obstructive pulmonary disease[J]．American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine，2013，234(3)：149-161．

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[4] 宋一平，崔德健，茅培英，等．慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立及药物干预的影响[J]．中华内科杂志，2000，39(8)：51．

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[6] 鱼 涛, 魏亚东, 赵梅梅,等. 加味清金化痰汤配合西药治疗痰热壅肺型慢性阻塞性肺病及对肺功能的影响[J]. 陕西中医, 2015, 36(4):409-410.

[7] 马 艳，田金娜，陈志富，等．竹沥颗粒和鲜竹沥液治疗小儿痰热咳嗽随机对照临床试验[J]．中国药业，2012，21(8)：34-35．

[8] 郑鸿燕，李志军．鲜竹沥口服液辅助治疗COPD急性发作疗效观察[J]．新中医，2016,48(4)：222-224．

[9] 孙红梅．氨溴索口服液与鲜竹沥液辅助临床治疗呼吸道感染疗效探讨[J]．继续医学教育，2016, 30(5):157-158．

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[11] 方 荣，王 倩，冯丽伟，等．IL-13、TNF-α在慢性阻塞性肺疾病和哮喘患者中的检测意义[J]．临床肺科杂志，2016，21(8)：1410-1413．

[12] 方志全，肖忠英．复方鲜竹沥液治疗慢性阻塞性肺疾病32例[J]．河南中医，2016，36(6)：1027-1029．

EffectofbamboojuiceonlungtissueofratswithCOPDinAQP1,AQP4,AQP5,TNF-andIL-6

Luo Jianjiang，Ma Hongxia.

The Fourth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University (Urumqi 830000)

Objective: To observe the effect ofbamboo juice on lungtissue of rats with COPD in AQP1, AQP4, AQP5, TNF- and IL-6, To explore the possible mechanism of COPD patients with phlegm effect of juice.Methods: 30 male Wistar rats, fed after 1 weeks were randomly divided into control group, model group and intervention group, 10 rats in each group, except the blank group, other groups were treated with cigarette smoking combined with elastaseintratracheal instillation of COPD rats model was established, 90 days later, the intervention group in xianzhuli oral liquid gavage for 10 days, the two other groups were saline for 10 days. After the intervention, the expression of AQP1, AQP4 and AQP5 were observed by PCR method. The levels of TNF- and IL-6 in lung tissue were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Results: Compared with the blank group, the concentrations of AQP1, AQP4 and AQP5 in the lung tissue of model group and intervention group were significantly decreased (P< 0.01), and the levels of TNF- and IL-6 were significantly higher (P< 0.01). Compared with the model group, the lung tissue AQP1 and AQP5 concentrations in the intervention group were significantly increased (P< 0.01), AQP4, TNF- and IL-6 concentrations were significantly decreased (P< 0.01), the difference was statistically significant.Conclusion: Bamboo juice have a curative effect of COPD may be related to the regulation of aquaporin 1 and aquaporin 5 (AQP1), (AQP5) transporter, inhibition of tumor necrosis factor alpha (TNF- alpha), interleukin 6 (IL-6) expression is closely related to.

Pulmonary disease, chronic obstructive/traditional Chinese medicine therapy Liquor phyllostachys Aquaporins Animal experimentation Rats

*新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2015211C149)

△通讯作者

肺疾病, 慢性阻塞性 /中医药疗法 竹沥 水通道蛋白类 动物实验 大鼠

R563

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.11.061

(收稿：2017-06-28)