荞麦派伦霉叶斑病病原学研究

田小曼，李朝红

(1.杨凌职业技术学院，陕西杨凌712100；2.汉中职业技术学院，陕西汉中 723002)

荞麦派伦霉叶斑病病原学研究

田小曼1，李朝红2

(1.杨凌职业技术学院，陕西杨凌712100；2.汉中职业技术学院，陕西汉中 723002)

2015年，在陕西榆林地区发现一种新的荞麦叶部病害，发病叶片上出现坏死斑，中间浅褐色，边缘褐色，外围有褪绿晕圈，发病严重时叶片枯死。为明确引起该病害的病原菌种类，采用组织分离法分离和纯化得到真菌分离物。通过柯赫氏法验证、形态学观察和rDNA-ITS序列分析(GenBank注册号：LC208725.1)，确定该病害病原菌为荞麦派伦霉叶斑病菌(Peyronellaeacalorpreferensi,又名Didymellaheteroderae)。这是派伦霉所致荞麦叶斑病在中国的首次报道。

荞麦；派伦霉属；形态特征；分子鉴定

荞麦是蓼科(Polygonaceae) 荞麦属(Fagpyrum)作物, 有苦荞(F.tataricum)和甜荞(F.esculentum) 2 个栽培种，起源于中国，具有生长期短、适应性强的特点[1]。荞麦是一种医食同源的食物，除含有蛋白质、脂肪、淀粉、矿质元素和维生素外，还含有丰富的芦丁，不仅能降血脂、降血糖、降胆固醇，而且对防治糖尿病等也有一定疗效，已成为 21 世纪人类的绿色食品之一[2-3]。中国是世界上荞麦栽培面积最大的国家，每年种植面积达70万hm2，总产量0.735亿kg，荞麦主栽区为中国东北、华北、西北和西南(云、贵、川)一带的高寒山区或丘陵地区，管理粗放，品种混杂，使得荞麦病害的种类日趋增多且危害程度日趋严重[4]。

2015年进行的病害调查中，在陕西榆林荞麦种植区发现一种叶部病害，不同于常见的叶斑病、轮纹病和褐斑病，病害发展迅速，可导致大面积荞麦发病叶片干枯死亡，严重影响荞麦生产。本文采用形态学观察、系统发育分析及致病性测定，明确该病害的病原菌种类，为正确诊断和及时有效防治该病害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病样采集和病原菌的分离与纯化

2015年7月在陕西省榆林市荞麦种植区采集典型发病的荞麦病叶，品种为‘西农9920’，采用组织分离法分离和纯化病原菌[5]。选取荞麦病叶病健交界处剪成4 mm2左右的组织块，进行表面消毒(φ=70%酒精浸泡1 min，1 g/mL NaClO消毒3 min，灭菌水冲洗3次)；然后将消毒过的病组织置于PDA平板上，于25 ℃恒温培养。待长出菌落后，挑取菌落边缘的少量菌丝于PDA上进行纯化培养，进一步经单孢分离获得病原菌的纯培养物。

1.2 致病性测定

致病性测定在四叶期的荞麦幼苗上进行，品种为‘西农9920’。将在PDA培养基上25 ℃培养 5 d 的菌落用无菌水洗下来，用4层无菌纱布过滤，并将滤液制成105～106CFU/mL的孢子悬浮液，加入φ=0.1% 的Tween 80。对照用含φ=0.1% Tween 80的无菌水。采用刺伤和喷雾法进行接种，刺伤法用灭菌针头轻轻扎破表皮后，每个伤口接种5 μL孢子悬浮液，对照用针刺后在伤口接 5 μL 含φ=0.1% Tween 80的无菌水；喷雾法将孢子悬浮液用喷雾器均匀喷洒到植株表面，以无菌水接种的为对照。每个处理接种10株，接种后保湿24 h后，植株置温室培养[(25 ± 1)℃，16 h 光照]，定期观察发病情况。待叶片上长出病斑后，重新分离病原菌，进行柯赫氏法则验证。

1.3 病原菌的形态特征和培养性状观察

将致病性接种试验确证的病原菌在PDA培养基上活化培养后，用灭菌打孔器(直径0.5 cm)打取菌饼接于新配置的PDA平板和燕麦培养基(50 g燕麦片加水1 L，在沸水浴上加热1 h，纱布过滤后加水补足1 000 mL，加15～18 g琼脂粉，分装后121 ℃灭菌30 min)，于25 ℃黑暗/光照培养3 d 后每天观察菌落形态及培养性状， 用十字交叉法测量菌落生长直径，计算生长速率。待培养基中长出黑色小颗粒后，在光学显微镜下观察分生孢子器和分生孢子的形态、大小，分生孢子的隔膜有无及数目、产孢结构的形态特征并显微拍照。每个处理接种6个培养皿。

1.4 病原菌的分子鉴定

1.4.1 基因组DNA提取 取菌株YLQM05菌块接于马铃薯葡萄糖培养液中，在25 ℃、120 r/min 条件下振荡培养3～4 d，过滤收集菌丝体，采用CTAB法提取DNA[6]。

1.4.2 rDNA-ITS序列的PCR扩增 利用通用引物ITS1 和 ITS4[7]扩增核糖体基因转录间隔区(rDNA-ITS)。引物序列为：上游引物 ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和下游引物ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGAGATATGC-3′。PCR产物用TaKaRa 琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收纯化，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，以DNA Maker DL2000为对照检测产物片段大小。

1.4.3 序列比对及系统发育进化树的构建 将PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将获得的菌株序列在NCBI网站上利用BLAST比对分析，在GenBank中查找相关序列，获取目标菌株信息并下载相关序列。本研究所下载序列选择衍生模式培养菌株或标准菌株。将下载的序列和目标菌株序列整理，应用Clustal X(1.83)软件进行比对分析，由BioEdit 5.0.9.1进行修正，然后利用软件MEGA 6.06邻接法构建系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 病害症状

荞麦叶斑病主要为害叶片，发病率可达60%，严重田块可达100%。发病初期，叶片上出现中央灰白，外围紫红色的坏死斑，后期发展为大小不一的近圆形轮纹状病斑，病斑边缘不明显，病斑中央浅褐色，四周褐色，外围有褪绿晕圈，发病严重时病斑融合，叶片黄化枯死(图1)。后期病斑上生出黑色小粒点，即病原菌分生孢子器。经病原菌分离和纯化，从具有典型症状的病叶组织上获得一株真菌(编号YLQM05)。

2.2 对荞麦的致病性测定

在荞麦四叶期采用刺伤和喷雾法进行接种，刺伤接种的植株发病快且严重，接种5 d后在针刺接种处发现灰色坏死斑，外围有褪绿晕圈，10 d后病斑表面有少量小黑点，为病原菌的分生孢子器(图2)。喷雾接种的植物发病缓慢，仅在叶片表面形成少量坏死斑，未接种病原菌的对照未发病。对发病的叶片用组织分离法重新分离获得病原菌，且与田间采集病叶上分离的病原菌形态一致。证明分离的病原菌对荞麦具有致病性。

A.发病田块 Diseased field；B.单个叶片 Single leaf

A.针刺接种 Needle-prick wounding inoculation；B.喷雾接种 Spray inoculation；C.针刺接种对照 Needle-prick wounding control

2.3 病原菌的分离与形态观察

从荞麦叶斑病病部分离的真菌分离物，在PDA平板25 ℃黑暗条件下，3 d菌落直径为4.0 cm。菌落呈圆形，前3 d的时候菌落为白色，第4天起菌落变成灰黑色，中间有小黑点，为病原菌的分生孢子器。病原菌在PDA培养基上的生长不受光照的影响，都能产生分生孢子器(图3-A)，而在燕麦培养基上，黑暗条件下可以产生少量的分生孢子器(图3-B)，光照条件下基本不产生(图3-C)。在PDA培养基上第10天，菌落呈黑褐色，基部有大量的小黑点(图3-D，3-E)。分生孢子器未成熟时呈梨形(图3-F)，大小为(55～63) μm×(86～98) μm，成熟后近球形(图3-G)，具孔口，直径96～118 μm。分生孢子卵圆形至椭圆形，两端钝圆，无色，单胞，有两个油点4.7(4.1～5.5) μm×2.8 (2.5～3.4) μm (图3-H)。

A.PDA上菌落形态(5 d) Colony on PDA (5 days)；B.OM上菌落形态(黑暗5 d) Colony on oatmeal agar (dark 5 days)； C.OM上菌落形态(5 d光照) Colony on oatmeal agar (light 5 days)；D, E.PDA上分生孢子团(10 d) Conidial masses formed on PDA (10 days)；F.未成熟的分生孢子器 Immature pycnidium；G.成熟的分生孢子器 Mature pycnidium; H.分生孢子 Conidia;标尺：F, G=50 μm, H=5 μm Bars: F,G=50 μm, H=5 μm

图3荞麦叶斑病病原菌形态Fig.3Morphologicalcharacteristicsofpathogen

2.4 病原菌的分子鉴定

将PCR特异性扩增产物送样测序，GenBank中的注册号为No. LC208725.1，利用Clustal X(1.83)、BioEdit 5.0.9.1和MEGA 6.06等软件构建系统发育树(图4)。所选菌株均是衍生主模式或衍生等模式菌株和被广泛承认的各个种的标准菌株(表1)。系统发育树分析表明，供试菌株YLQM05和菌株CBS 875.97、CBS109.92及PD96/2022聚在一个大的分枝上，支持率为94%，而CBS 875.97、CBS109.92及PD96/2022是Peyronellaeacalorpreferens，说明供试菌株YLQM05为P.calorpreferens(图4)。

图4 基于rDNA-ITS序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequences

种类Species菌株号Strainnumber登录号GenBankAccessionNo.参考文献ReferencesBoeremiaexiguaCBS431.74FJ427001AveskampMM(2009)[8]BoeremiaexiguaCBS101150GU237715AveskampMM(2010)[9]BoeremiaexiguaCBS569.79GU237892AveskampMM(2010)ConiothyriumglycinesCBS124141KF251211QuaedvliegW(2013)[10]PeyronellaeacalorpreferensCBS109.92*FJ426983AveskampMM(2009)PeyronellaeacalorpreferensCBS875.97GU237908AveskampMM(2010)PeyronellaeacalorpreferensPD96/2022GU237925AveskampMM(2010)PeyronellaeaobtusaCBS391.93GU237858AveskampMM(2010)PeyronellaeaobtusaCBS377.93GU237847AveskampMM(2010)PeyronellaeapinodellaCBS567.97GU237891AveskampMM(2010)PeyronellaeapinodellaCBS110.32EU167565Simon,U.K.(2009)[11]

3 讨 论

通过对陕西省榆林市荞麦种植区新发现的叶斑病病原菌的致病性测定、形态特征观察、rDNA-ITS序列分析，证明该病害是由(Peyronellaeacalorpreferens)侵染引起的。该病原菌可导致荞麦发病叶片干枯死亡，植物生长衰弱，甚至整株植株干枯死亡，严重影响荞麦生产。

本研究在陕西榆林发现的荞麦叶部病害与荞麦叶斑病、荞麦褐斑病、荞麦轮纹病症状相似，但病原菌形态相差较大。戴芳澜[12]报道荞麦叶斑病是由荞麦叶点霉(Phyllostictafagopyri)引起，病斑圆形，初期褐色，从中央向外变灰色，有褐色边缘，在此边缘内有一圈青灰色部分，直径2～5 mm；分生孢子器叶面生，小，散生，埋生，无孔口，近球形，带黑色，直径35～40 μm；分生孢子卵形或宽椭圆形，无色，无油点，两端圆，(4～5) μm× (3～3.5) μm。魏景超[13]报道荞麦褐斑病是由荞麦尾孢(CercosporafapopyriNakaterer et Takoimato)引起，叶片病斑圆形或不规则形，边缘深褐色，微具轮纹，病斑中央灰绿色至褐色，严重时病斑连成一片，呈不规则形。分生孢子梗单生或束生，分生孢子针形，直或微弯，基部平截或圆形，无色, 有1～9 个隔膜，大小为(50～150) μm×(2～4) μm。Bresadola[14]报道荞麦轮纹病是由(AscochytafagopyriBres.)引起，主要侵害荞麦叶片和茎秆。叶片上产生中间较暗淡褐色病斑，病斑呈圆锥或近圆形，直径2～10 mm，有同心轮纹，病斑中间有黑色小点，即病菌的分生孢子器。茎秆受害后，病斑呈梭形，椭圆形，红褐色。植株死后变为黑色，上生有黑褐色小斑。分生孢子器生在叶表面，埋生在组织里，球形，大小(88～150) μm×(88～138) μm，有孔口。分生孢子椭圆筒形，直或稍弯曲，两端钝，无色，大小(8.7～17.5) μm×(3.7～6.5) μm，有1个隔膜或无。本研究经过柯赫氏法验证、形态学观察和rDNA-ITS序列分析将该病原菌鉴定为P.calorpreferens。

Aveskamp等[8]依据形态学和分子生物学特征，将Phomapomorumvar.calorpreferens提升为Phomacalorpreferens种，Aveskamp等[9]依据多基因序列特征，将Phomacalorpreferens归为Peyronellaea属，定种为Peyronellaeacalorpreferens，并将Phomaheteroderae作为它的异名。Peyronellaeacalorpreferens最早从荷兰的一种无名食材上分离得到，目前，该种分布于世界各地，是一种常见的土壤习居菌和植物内生菌。Chen等[15]研究发现Peyronellaeacalorpreferens与Didymellaheteroderae为同一真菌，在GeneBank中以Didymellaheteroderae提交。

Boerema[16]认为该种是种子植物的一种机会致病菌。在病原菌的致病性试验过程中发现，从荞麦叶片上分离的P.calorpreferens在针刺接种的时候发病快，产生叶斑症状，且病斑上能产生小黑点，即病原菌的分生孢子器；而无伤接种时发病缓慢，病斑上不产生小黑点，表明该菌寄生性或致病性较弱。

Reference：

[1]林汝法,柴 岩,廖 琴.中国小杂粮[M].北京:中国农业科技出版社,2005.

LIN R F,CHAI Y,LIAO Q.Minor Grain Crops in China[M].Beijing:China Agricultural Technology Press,2005(in Chinese).

[2]LEE C C,SHEN S R,LAI Y J.Rutin and quercetin,bioactive compounds from tartary buckwheat,prevent liver inflammatory injury[J].Food&Function,2013,4(5):794-802.

[3]KOYAMA M,NAKAMURA C,NAKAMURA K.Changes in phenols contents from buckwheat sprouts during growth stage[J].JournalofFoodScienceandTechnology,2013,50:86-93.

[4]向达兵,彭镰心,赵 钢,等.荞麦栽培研究进展[J].作物杂志,2013(3):1-6.

XIANG D B,PENG L X,ZHAO G,etal.Research progress on cultivation in buckwheat[J].Crops,2013(3):1-6(in Chinese with English abstract).

[5]方中达.植病研究方法[M].第3版.北京:中国农业出版社,1998:122-145.

FANG ZH D.Methodology on Plant Pathology Research[M].3rd edition.Beijing:China Agricultural Press,1998:122-145(in Chinese).

[6]张颖慧,魏东盛,邢来君,等.一种改进的丝状真菌 DNA 提取方法[J].微生物学通报,2008,35(3):466-469.

ZHANG Y H,WEI D SH,XING L J,etal.A modified method for isolating DNA from fungus[J].Microbiology,2008,35(3):466-469(in Chinese with English abstract).

[7]WHITE T J,BRUNS T,LEE S,etal.Amplification and Direct Sequencing of Fungal Ribosomal RNA Genes for Phylogenetics.PCR Protocols:a Guide to Methods and Applications[M].California:Academic Press,San Diego,1990:315-322.

[8]AVESKAMP M M,VERKLEY G J,DE GRUYTER J,etal.DNA phylogeny reveals polyphyly ofPhomasectionPeyronellaeaand multiple taxonomic novelties[J].Mycologia,2009,101(3):363-382.

[9]AVESKAMP M M,DE GRUYTER J,WOUDENBERG J H,etal.Highlights of the Didymellaceae:A polyphasic approach to characterise Phoma and relatedPleosporalesgenera[J].StudiesinMycology,2010,65:1-60.

[10]QUAEDVLIEG W,VERKLEY G J,SHIN H D,etal.Sizing upSeptoria[J].StudiesinMycology,2013,75(1):307-390.

[11]SIMON U K,GROENEWALD J Z,CROUS P W.Cymadothea,an obligate biotrophic leaf parasite ofTrifolium,belongs toMycosphaerellaceaeas shown by nuclear ribosomal DNA analyses[J].Persoonia,2009,22:49-55.

[12]戴芳澜.中国真菌总汇[M].北京:科学出版社,1979.

DAI F L.Sylloge Fungorum Sinicorum[M].Beijing:Science Press,1979(in Chinese).

[13]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979.

WEI J CH.Fungal Identification Manual[M].Shanghai:Shanghai Science and Technology Press,1979(in Chinese).

[14]BRESADOLA G.Fungi aliquot Saxonici novi lecti a cl.W Krieger[J].Hedwigia,1892,31:40-41.

[15]CHEN Q,JIANG J R,ZHANG G Z,etal.Resolving thePhomaenigma[J].StudiesinMycology,2015,82:137-217.

[16]BOEREMA G H.Contributions towards a monograph ofPhoma(Coelomycetes)-Ⅱ.SectionPeyronellaea[J].Persoonia,1993,15:197-221.

PathogenofPeyronellaeaLeafSpotinBuckwheat

TIAN Xiaoman1and LI Zhaohong2

(1.Yangling Vocation and Technical College, Yangling Shaanxi 712100, China；2.Hanzhong Vocational and Technical College,Hanzhong Shaanxi 723002，China)

In 2015, a new disease of leaf spot in buckwheat was observed in Yulin, Shaanxi Province, which could cause necrosis with brown edge, and it was surrounded by pale green ring. The heavy diseased leaves turned yellow and died. The pathogen strain was isolated and purified by tissue isolation method. Based on morphological observation, sequence analysis of rDNA-ITS(GenBank Accession No. LC208725.1), and Koch’s postulate, the pathogen was identified asPeyronellaeacalorpreferensi, also namedDidymellaheteroderae.P.calorpreferensi infecting buckwheat was reported first time in China.

Buckwheat;Peyronellaeacalorpreferensi; Morphological characters; Molecular identification

2016-09-30

2017-03-24

TIAN Xiaoman,female, associate professor.Research area:plant protection.E-mail:yltxiaoman@163.com

S435.17

A

1004-1389(2017)10-1544-06

日期：2017-10-18

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171018.1733.036.html

2016-09-30

2017-03-24

田小曼，女，副教授，从事植物保护方面的研究。E-mail：yltxiaoman@163.com

(责任编辑：郭柏寿Responsibleeditor:GUOBaishou)