鱼腥草内生真菌多样性分析

2017-11-13崔文霞张峰华崔忠华李勤凡

西北农业学报 2017年10期

关键词：孢属鱼腥草内生

崔文霞，陈睿，张峰华，崔忠华，李勤凡

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.动物疾病预防控制中心，陕西临潼 710600)

鱼腥草内生真菌多样性分析

崔文霞1，陈睿1，张峰华1，崔忠华2，李勤凡1

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.动物疾病预防控制中心，陕西临潼 710600)

为探索鱼腥草(HouttuyniacordataThunb)内生真菌类群组成及多样性，采用组织分离法对不同季节、不同部位的鱼腥草内生真菌进行分离，以形态学和分子生物学方法鉴定，通过分离频率、Shannon-Wiener多样性指数等分析鱼腥草内生真菌的多样性。结果表明，分离得到内生真菌3 822 株，分属于19 个属，其中交链孢属Alternaria和镰孢菌属Fusarium为优势菌群,分别达37.55%和18.50%；在夏季分离得到的内生真菌最多；根中分离得到的内生真菌Shannon-Wiener多样性指数(H′)最大，为2.06；不同季节中鱼腥草内生真菌春季和夏季的相似性最高，为0.74；不同组织中叶与花的相似性最高，为0.83。鱼腥草内生真菌具有多样性，不同季节和不同组织部位的鱼腥草内生真菌存在差异性。

鱼腥草；内生真菌；优势菌群

植物内生真菌(Fungi endophyte)指在其生活史中某一段时期内或整个生命时期生活于植物组织内部，对其宿主不引起明显疾病的一类真菌[1]。研究发现，内生真菌普遍存在于目前研究的各种植物中，具有丰富的物种多样性[2-4]。植物内生真菌在宿主水平甚至在同一宿主不同组织之间都存在偏好性[5-6]，故研究内生真菌多样性对理解其与宿主的生态演化、发掘活性菌株等具有重要意义。

鱼腥草(HouttuyniacordataThunb)是一种常见的中草药，具有清热解毒，化痰止咳和利尿涌淋等功效[7]。李光富等[8]从鱼腥草中分离得到13 株内生真菌，其中12 株内生真菌发酵液有抑菌活性；刘正琼[9]对鱼腥草内生真菌进行分离鉴定及抑菌活性研究，结果表明鱼腥草内生真菌十分丰富，共分离得到127 株内生真菌，且有26 株内生真菌能够同时抑制3 种以上病原菌。但有关鱼腥草内生真菌的系统研究还未见报道，本研究对鱼腥草内生真菌进行分离、鉴定，探究鱼腥草内生真菌的菌群多样性，了解不同季节、不同部位鱼腥草内生真菌的组成与分布，为进一步研究鱼腥草与内生真菌的关系以及内生真菌资源利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

鱼腥草全草样品分别于2012年9月(秋)、2013年4月(春)和2013年6月(夏)采自陕西省西安市长安区滦镇(E108.62°，N33°47′)，选择6～10个采样点，每个采样点采集植物样本约10株。样品采集后，立即放入密封袋带回实验室，4 ℃ 保存，3 d内完成内生真菌的分离。

1.2 内生真菌的分离纯化

参照文献[10]对鱼腥草植株进行表面消毒，并将其切成0.5 cm3大小的组织块，接种于PDA平板，20 ℃避光培养7～10 d。待切口处长出菌丝，采用尖端菌丝挑取法对所分离的内生真菌进行反复分离纯化，待纯化后转移到 PDA 斜面中保存。表面消毒效果的检验采用漂洗液检验法和组织印迹法。

1.3 内生真菌种属鉴定

1.3.1 形态学鉴定采用点植法和插片法，对分离得到的内生真菌进行显微形态观察，根据其菌丝颜色、孢子形态、产孢结构等特征进行初步鉴定[11]。

1.3.2 分子生物学鉴定利用真菌DNA提取试剂盒提取DNA，以真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)为引物，扩增ITS保守区域[12-13]。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序。将所得序列在GenBank中BLAST比对，使用MEGA 6.0 进行序列分析，采用邻近连接法(Neghbor-joining)1 000 次重复自展构建系统发育树，并结合形态学观察结果确定菌株种属。

1.4 内生真菌多样性分析

采用分离频率、Shannon-Wiener 多样性指数、均匀度指数、相似性指数分析鱼腥草内生真菌的多样性以及分布特性[12,14-15]。

2 结果与分析

2.1 鱼腥草内生真菌分离

通过从不同季节不同组织部位的3 435个鱼腥草组织样品中共分离得到内生真菌3 822 株，其中从根分离834 株、茎1 177 株、叶1 521 株、花290 株；春季 411 株、夏季 2 782 株、秋季 629 株。经菌株群落的培养特征初步划分为116 个形态型，部分菌落照片及其主要形态特征分别见图1和表1。

2.2 鱼腥草内生真菌分子生物学鉴定

结合形态学特征和真菌5.8S rDNA-ITS序列分析，将从鱼腥草组织中分离得到的内生真菌划分为55 个分类单元。其中，33 个鉴定到种水平，19 个到属水平，1 个到科水平，1 个到门水平。在目的分类水平上，以丛梗孢目Moniliales为优势菌群，占总菌株数量的70.69%；在科的分类水平上，暗梗孢科Dematiaceae占总菌株数量的38.41%；在属的水平上以交链孢属Alternaria和镰孢菌属Fusarium为优势类群，分别占总菌株数量的37.55%和18.50%(图2)。

图中A为秋季的缩写，Y、J、 G 为叶、茎和根的缩写，1、2、3、7、8、10、17、18、19为分离出的内生真菌 A is the abbreviation of autumn,Y,J and G are the abbreviation of leaf,stem and root,respectively. 1,2,3,7,8,10,17,18 and 19 are the serial of endophytic fungi isolated.下表同 The same below.

图1 纯化后内生真菌Fig.1 Purified fungi isolated from Houttuynia cordata Thunb

图2 鱼腥草内生真菌的组成Fig.2 Composition of endophytic fungi isolated from Houttuynia cordata Thunb

2.3 鱼腥草内生真菌多样性分析

2.3.1 不同季节由表2可知，夏季分离得到的菌株最多，为2 782 株，秋季629 株，春季411 株。从真菌种属来看，夏季分离得到的内生真菌类群最多，为14 个属，春季为13 个属，秋季最少，为9个属。在3 个季节中，鱼腥草内生真菌中都以交链孢属(Alternaria)为优势菌群，但夏季的分离频率远高于其他2季。春夏的第2优势菌群为镰孢菌属(Fusarium)，分别为22.14%、19.12%，而秋季为附球菌属(Epicoccum)，为15.90%。此外，不同季节的鱼腥草也各有其特色的内生真菌种属，春季的笋顶孢霉属(Acrostalagmus)、白粉寄生孢属(Ampelomyces)和四分枝孢属(Tetracladium)；夏季的毛壳菌属(Chaetomium)、叶点霉属(Phyllosticta)和赤霉属(Gibberella)；秋季的聚端孢属(Trichothecium)和木霉属(Trichoderm)(表3)。

从Shannon-Wiener多样性指数(H′)来看，各个季节的多样性指数平均值为1.88，说明不同季节内生真菌多样性表现比较一致；春季的丰富度指数最高，为1.38。秋季的均匀度指数最高(表2)。

图3 基于ITS序列由邻近法构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree constructed with the program Neighbor-joining (NJ) based on ITS sequences

2.3.2 不同组织从鱼腥草的根部组织分离出内生真菌834 株，隶属于16 个属；从茎中分离出1 177 株，隶属于13 个属；叶分离出1 521株，隶属于7个属；花中分离出290 株，隶属于5 个属。根中以镰孢菌属(Fusarium)为主，为26.98%，叶、茎、花组织中均以交链孢属(Alternaria)为主，分别为45.43%、39.93%、59.66%。交链孢属(Alternaria)、刺盘孢属(Colletotrichum)、镰孢菌属(Fusarium)、茎点霉属(Phoma)为个体不同部位的共同菌种。同时，鱼腥草中有些内生真菌具有一定的组织专一性。只在茎中分离得到笋顶孢霉属(Acrostalagmus)、白粉寄生孢属(Ampelomyces)和叶点霉属(Phyllosticta)；而聚端孢属(Trichothecium)、木霉属(Trichoderma)等只从根中分离得到(表3)。

从多样性指数来看，鱼腥草不同组织部位的多样性指数差别较大。根中 Shannon-Wiener 多样性指数(H′=2.06)和Margalef 丰富度指数(R=1.55)最大，表明鱼腥草根中内生真菌的多样性和丰富度最高。叶的均匀性指数最高，为0.80。花的Shannon-Wiener 多样性指数、Margalef 丰富度指数及均匀度指数最低，分别为1.17、0.49、0.73(表2)。

表2 鱼腥草内生真菌菌群多样性分析Table 2 Diversity indices of endophytic fungi from Houttuynia cordata Thunb

表3 不同季节和不同组织鱼腥草内生真菌菌落的组成Table 3 Composition of endophytic fungi isolated from different tissues of Houttuynia cordata Thunb in various seasons

2.4 鱼腥草内生真菌菌群的相似性分析

3个季节的相似性比较结果表明，春季和夏季的相似性最高，为0.74；春季和夏季的相似性为0.61；秋季和春季的相似性最低，为 0.55。从鱼腥草组织间分布的内生真菌菌群的相似性来看，叶子与花的相似性最高，为 0.83；茎与花的相似性最低，为 0.44。

3 讨论

本试验从鱼腥草植株中分离得到3 822株内生真菌，利用形态学和5.8S rDNA-ITS序列分子鉴定的方法将其鉴定为55 个分类单元，分布在3 个亚门7 个纲7 个目19 个属，交链孢属(Alternaria)和镰孢菌属(Fusarium)为优势菌群。由此可知，鱼腥草中蕴藏丰富的内生真菌，且受组织部位、生长时间等因素的影响，有些内生真菌表现为一定的宿主偏好性。根中菌株数量与属的类别呈相反趋势，根部适宜较多类群的菌株生长繁殖，这与白周艳等[16]报道结果一致，是因为根际真菌在长期的适应过程中选择性的进入植物体内，而根内真菌数较少，是由于根内较多的细菌和放线菌对真菌有颉颃作用。花中分离得到的内生真菌数量及属的类别均最少，这与花的生存时间较短有一定关系；夏季分离得到的内生真菌数量及菌属类别均多于春秋，较高的温度适宜真菌生长，植物体内的真菌不断增殖，体外的真菌可通过自然孔口或伤口等渠道侵入到植物体内[17]。

多样性分析中，Shannon-Wiener多样性指数用来估算群落多样性的高低；均匀度指数用来描述物种中个体的相对丰富度[18-19]。本试验中鱼腥草内生真菌多样性水平差异适中，相近程度较好，这一定程度上表明在长期的协同进化过程中，内生真菌群与鱼腥草植株形成相对稳定的关系。目前国内外还未见关于鱼腥草内生真菌多样性的研究，故无法与其他地区鱼腥草多样性指数对比。为更好地研究鱼腥草内生真菌种群多样性，有必要采集更多不同地区的样品，获得更多可培养的内生真菌，其结果可为今后深入探讨不同地域鱼腥草内生真菌多样性提供理论依据，也为进一步阐明鱼腥草与内生真菌相互关系、发掘活性菌株奠定基础。

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DiversityofEndophyticFungiinHouttuyniacordataThunb

CUI Wenxia1,CHEN Rui1,ZHANG Fenghua1,CUI Zhonghua2and LI Qinfan1

(1.College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China;2.Animal Disease Prevention and Control Center,Lintong Shaanxi 710600,China)

The composition and diversity of endophytic fungal taxa inHouttuyniacordataThunb was analyzed. Endophytic fungi from different seasons (autumn,spring and summer) and different parts (root,stem,flower and leaf) ofHouttuyniacordataThunb were isolated by tissue expand method. Strains were classified by morphology and similarity of internal transcribed spacer (ITS) sequence. Composition,diversity of endophytic fungal community were analyzed by the isolation rate(IR),isolation frequency(IF),Shannon-Wiener biodiversity index (H′) and Margalef richness index(R).3 822 strains fromHouttuyniacordataThunb were divided into 19 genera,55 species,of whichAlternariaandFusariumwere predominant,respectively accounting for 37.55% and 18.50% of the total. The endophytic fungi of summer were the most among the 3822 strains. The Shannon-Wiener biodiversity index associated with roots was the highest (H′=2.06). The highest Sorensen coefficient was detected in spring and summer(Cs=0.74). Among the different tissues,the highest Sorensen coefficient was in leaf and flower(Cs=0.83).The endophytic fungi inHouttuyniacordataThunb have abundant diversity. Meanwhile,there were some notable differences between distribution and composition of the endophytic fungi isolated from different seasons and different parts ofHouttuyniacordataThunb.

HouttuyniacordataThunb; Endophytic fungi; Dominant population

2016-06-28

2016-08-30

CUI Wenxia,female,master student. Research area: animal clinical diseases. E-mail:572038273@qq.com

S567.23+9

1004-1389(2017)10-1513-07

日期：2017-10-18

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171018.1733.025.html

2016-06-28

2016-08-30

崔文霞，女，硕士研究生，研究方向为动物临床疾病。E-mail:572038273@qq.com

李勤凡，男，副教授,硕士生导师，研究方向为动物临床疾病。E-mail:liqf1131@163.com