Surfactin作为表面活性剂对O/W型藻油DHA乳状液物理和氧化稳定性的影响

何镇宏，赵海珍，陆兆新*

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

Surfactin作为表面活性剂对O/W型藻油DHA乳状液物理和氧化稳定性的影响

何镇宏，赵海珍，陆兆新*

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

以Surfactin作为表面活性剂制备藻油二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）乳状液并研究其稳定性。研究发现，水相为质量分数0.8%的Surfactin溶液，在不添加助表面活性剂和其他添加剂的条件下，制备水包油型藻油DHA乳状液，在4 ℃和37 ℃条件下保存相比其他表面活性剂具有良好的物理稳定性，在浊度、粒径、Zeta电位和流变学角度与Tween-80-丙三醇等表面活性剂制备的藻油DHA乳状液相比均有显著差异（P＜0.05），Surfactin藻油DHA乳状液在各方面均优于其他表面活性剂的藻油DHA乳状液。在高温处理和常温贮存过程中，Surfactin藻油DHA乳状液的氧化稳定性也十分优良，在37 ℃贮存60 d乳状液过氧化值始终处于较低水平，仅为（1.635±0.202）meq/kg。

Surfactin；藻油DHA乳状液；物理稳定性；氧化稳定性

藻油单细胞油是从双鞭甲藻（Crypthecodinium cohnii）中提取出的ω-3系列不饱和脂肪酸混合物[1]，同鱼油一样，富含二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）。藻油中DHA的含量约是鱼油中的3～10 倍，也因其安全高效、重金属污染少、气味较鱼油温和等特性成为美国食品和药物管理局唯一批准的儿童摄取DHA来源[2]。藻油DHA对儿童的生长发育、视觉发育、大脑发育以及提高婴幼儿免疫力都有积极的作用。成人服用藻油DHA也有抗肿瘤、预防神经性疾病、延缓衰老、降血压、降血脂、降胆固醇等多种保健作用[3-4]。然而由于藻油DHA分子内含有6 个双键，在自然环境中极易被氧化。受光照、温度、氧气等因素的影响，藻油DHA氧化会产生有害物质，严重降低藻油DHA的活性效果。

为了稳定藻油DHA，保护其在贮存过程中不被氧化，常用的方法就是微胶囊化或制备成微乳液，将DHA包埋在微胶囊或溶胀的胶束中，从而减少光照、温度、氧气对DHA的作用。乳化过程中常用表面活性剂和助表面活性剂来削弱胶束与连续相间的空间位阻和静电斥力，从而达到水包油（O/W）型乳状液的稳定形成[5]。Surfactin作为一类生物来源的环境友好型表面活性剂，在各领域一直作为生物表面活性剂的模式物质被研究。Surfactin是由7 个氨基酸组成的环肽（L-Glu→L-Leu→D-Leu→L-Val→L-Asp→D-Leu→L-Leu）和13～15 个碳的碳链组成的脂肽[6]。其中谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）提供亲水基团，其他氨基酸和碳链提供疏水基团，这种分子组成易于形成β-折叠及“马鞍型”结构[7]。Surfactin的这种特性使其拥有高的表面活性，在25 ℃时能将水的表面张力从72.8 mN/m降低到27.9 mN/m[8]。Surfactin作为表面活性剂在洗涤剂、化妆品、医药、饲料和石油等领域[9-10]都有广泛应用，而在食品领域作为乳化剂的应用前景广阔，但实际应用还较少[11]，仅停留在理论研究阶段。

本实验在食品级菌株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）中提取Surfactin，并将其用于藻油DHA乳状液的制备。在制备过程中不添加助表面活性剂及其他稳定剂，以期利用Surfactin的强表面活性制备粒径尽可能小、稳定性优良、安全而无添加剂的藻油DHA乳状液。在研究过程中，测定了藻油DHA乳状液的物理稳定性和氧化稳定性，并与其他表面活性剂制备的藻油DHA乳状液比较，以期获得稳定性优越的藻油DHA乳状液，从而为Surfactin在食品领域的应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Surfactin（纯度≥88.6%）为南京农业大学食品科技学院酶工程实验室自制，提取自实验室保存的Bacillus amyloliquefaciens fmb50。

藻油DHA单细胞油（DHA质量分数≥46.8%） 浙江亿叠生物科技有限公司；Tween-80、丙三醇（分析纯）国药集团化学试剂有限公司（上海）；单硬脂酸甘油酯（glycerin monostearate，GM）、蔗糖脂肪酸酯-11（sucrose fatty acid ester-11，SE-11）、大豆卵磷脂（soy lecithin，SL）（食品级） 浙江迪耳化工有限公司。

1.2 仪器与设备

D-3L高压均质机 美国PhD公司；NanoBrook 90Plus Zeta粒度分析仪 美国Brookhaven仪器有限公司；UV-2450紫外分光光度计 日本岛津有限公司；RST触屏流变仪 美国Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 藻油DHA乳状液的制备及乳状液类型确定

前期优化实验确定了藻油DHA乳状液制备的基本条件：藻油与表面活性剂的水溶液1∶3（m/m）混合，调pH值为7.0～8.0，经30 ℃、20 MPa初乳化1 次后，65 ℃、75 MPa均质3 次。对表面活性剂种类和浓度进行研究后，选择了Surfactin、Tween-80-丙三醇（2∶1，m/V）和食品级的GM、SE-11、SL作为乳化剂，表面活性剂溶液质量分数分别为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%。

染色法确定乳状液的类型。甲基橙染液为水溶性染料，在O/W型乳状液中扩散迅速且染色完全，而在W/O型乳状液中较难扩散。苏丹红染液为脂溶性染料，在W/O型乳状液中扩散迅速且染色完全，而在O/W型乳状液中较难扩散。比较2 种染液在乳状液中的扩散情况，即可判断乳状液类型。

1.3.2 乳状液浊度的测定

取乳状液样品，用去离子水稀释1 000 倍，混匀后双蒸水作为空白对照测定OD600nm。

1.3.3 乳状液粒径和Zeta电位的测定

取乳状液样品，用去离子水稀释1 000 倍，混匀后用NanoBrook 90Plus Zeta粒度分析仪测定样品粒径和Zeta电位。

1.3.4 乳状液流变学性质测定

取乳状液样品，RST触屏流变仪测定样品表观黏度（ηa）、剪切速率（）、剪切压力（τ）的关系，并根据下式奥斯特瓦尔德-德沃尔幂律关系计算样品的流动特性指数（n）、稠度系数（K）。

根据上述公式，结合牛顿黏性定律，当n=1时，流体为牛顿流体，其余情况为非牛顿流体；当n＞1时，流体为膨胀性流体；当n＜1时，流体为假塑性流体。

1.3.5 乳状液中DHA的过氧化值测定

不饱和脂肪酸在空气中易与氧气反应而酸败，氧化过程中活性氧的含量（即过氧化值，用碘的毫克当量表示，单位为meq/kg）能够反映油脂和脂肪酸的氧化程度[12]。

加速实验：取藻油DHA、藻油DHA乳状液样品，4、20、37、60、80、115 ℃处理30 min，取出迅速恒定至室温，按GB/T 5009.37—2003《食用植物油卫生标准的分析方法》[13]测定过氧化值。

贮存实验：取藻油DHA、藻油DHA乳状液样品，分别于4 ℃和37 ℃恒温静置60 d，期间测定过氧化值的变化。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 不同表面活性剂制备藻油DHA乳状液的物理稳定性

在微乳液的制备过程中，为了提升物理稳定性通常会加入助表面活性剂以进一步降低油、水相的界面张力。常用的助表面活性剂包括短链醇等都有毒性，而乙醇又不适于加入软饮料及蛋白含量高的食品中[14]。使用生物来源的强表面活性剂Surfactin和其他一些食品级表面活性剂在不添加助表面活性剂的情况下（对照为Tween-80-丙三醇，2∶1，m/V）制备藻油DHA乳状液，通过高压均质提升乳液稳定性，以求尽量达到类似微乳液的稳定效果。取制备成功的乳状液进行染色实验，向样品中分别加入1 滴甲基橙和1 滴苏丹红，结果发现各样品中甲基橙均能迅速扩散而苏丹红难以扩散，表明类型均为O/W型乳状液。

Surfactin和Tween-80-丙三醇溶液仅在质量分数0.2%时就能制备出较为稳定的乳状液。而GM、SE-11在质量分数小于0.6%，SL在质量分数小于0.8%时，制备出的乳状液在10 min内体系崩坏，水相和油相明显分层。不分层的乳状液通过测定OD600nm和粒径能大致反映乳状液的物理稳定性。乳状液的物理稳定性与乳状液中液滴（或胶束、微胶囊、固态颗粒等）的粒径、液体黏度、体系的电动电位（Zeta电位）等许多因素有关，OD600nm也能表观地反映出乳状液的大致物理稳定性[15]。

图1 表面活性剂对乳状液浊度的影响Fig. 1 Effects of surfactant type and concentration on OD600nm of emulsions

图2 表面活性剂对乳状液粒径的影响Fig. 2 Effects of surfactant type and concentration on particle size of emulsions

由图1、2可知，在质量分数较低时，随着表面活性剂质量分数的增加，乳状液的浊度和粒径显著降低，呈现负相关性。Surfactin和Tween-80-丙三醇在0.8%时，乳状液的浊度基本降到最低。此时Surfactin藻油DHA乳状液的粒径为（208.13±8.01）nm，而Tween-80-丙三醇乳状液粒径为（412.35±5.02）nm（其他乳化剂制备乳状液粒径均大于450 nm）。Surfactin参与制备的乳状液粒径仅为Tween-80-丙三醇制备乳状液的1/2，表明质量分数为0.8%时，Surfactin较Tween-80-丙三醇能够将藻油DHA/水的界面张力降得更低，且Surfactin与藻油DHA形成的乳状液滴直径更小，具有更好的分散性。此外，0.8%质量分数条件下Surfactin的藻油DHA乳状液OD600nm仅为0.157±0.009，而Tween-80-丙三醇达到0.493±0.019，是前者的3 倍之多。Dong Die[16]和Guan Yufang[17]等发现乳状液的浊度和其体系崩解过程的焓变（ΔH）有一定的联系。乳状液崩解过程中吉布斯自由能（ΔG）为负值，即为自发反应过程，在乳状液液滴体系崩解前，乳状液的浊度越大，ΔH也相应地越大。Surfactin藻油DHA乳状液的浊度较低，即体系所含能量较低，O/W体系相比Tween-80-丙三醇与藻油DHA形成的乳状液体系更为稳定。换言之，理论上Surfactin的藻油DHA乳状液比Tween-80-丙三醇的藻油DHA乳状液具有更好的热稳定性。

2.2 藻油DHA乳状液在贮存过程中的物理稳定性

由于在0.8%质量分数条件下Surfactin和Tween-80-丙三醇能够与藻油DHA形成较为稳定的乳状液，后续实验不再讨论其他表面活性剂和质量分数。

乳状液在不添加其他增稠剂等稳定剂的情况下，研究其粒径和电动电位（Zeta电位）的变化情况能够直观地反映物理稳定性[18]。液溶胶体系的破坏伴随着奥斯瓦尔德熟化现象的发生[19]。在藻油DHA乳状液体系中，随着少量液滴的破裂，小分子油滴增溶到较大颗粒乳状液液滴中，从而增大了体系的粒径。乳状液液滴在热运动碰撞过程中逐渐合并，最终导致破乳现象，乳状液体系逐渐崩解。

图3 4 ℃和37 ℃条件下贮存时间对乳状液粒径的影响Fig. 3 Effects of storage time on droplet size of emulsions at 4 and 37 ℃

由图3可知，在贮存过程中，Surfactin藻油DHA乳液37 ℃保存60 d仅为（239.15±2.02）nm，较初始粒径增大了28.2%，4 ℃保存60 d仅为（309.38±4.14）nm，较初始粒径增大65.2%。Tween-80-丙三醇藻油DHA乳液在37 ℃仅能稳定保存20 d，最终粒径较初始增大了37.6%,4 ℃保存时在35 d后破乳，较初始粒径增大28.7%。Surfactin藻油DHA乳状液的粒径在保存前和保存后均远小于Tween-80-丙三醇藻油DHA乳状液，不到其粒径的1/2，且在60 d的贮存期内表观性质较为稳定，呈现均一的乳胶形态。表明Surfactin能将油-水界面张力降得更低，在贮存过程中在油-水界面的吸附量比Tween-80-丙三醇更大，形成更紧密的单分子层界面膜，阻碍热运动碰撞造成的乳状液液滴合并的效果，使得Surfactin藻油DHA乳状液物理稳定性更强[20-21]。在37 ℃条件下Surfactin藻油DHA乳状液物理性质更加稳定，可能与Surfactin的克拉夫特点（Krafft point）有关。离子型表面活性剂在克拉夫特点附近具有最大的临界胶束质量浓度[22]，前期实验通过测定不同温度、不同质量浓度条件下的Surfactin水溶液的表面张力发现Surfactin的临界胶束质量浓度随温度的增高而增大，在25 ℃时仅为19 mg/L，在40 ℃时超过108 mg/L且达到最大值，即37 ℃时Surfactin在水中的溶解性基本达到最高，因而能更好地参与藻油DHA乳状液的油-水界面膜的形成。4 ℃保存60 d后，虽然乳状液粒径不大，但较初始增大幅度较大。由于Surfactin在4 ℃时溶解度下降，吸附在油-水界面上的Surfactin量减少，Surfactin单分子层排列没有37 ℃时紧密，形成的界面膜强度较小，因此稳定性小于37 ℃时，使得贮存过程中粒径增大。

图4 4 ℃和37 ℃条件下贮存时间对乳状液Zeta电位的影响Fig. 4 Effects of storage time on Zeta potential of emulsions at 4 and 37 ℃

Zeta电位表示连续相与胶束稳定层间的电势差，能够反映粒子间相互排斥的能力[23]。由图4可知，当Zeta电位的绝对值高于20 mV时，体系较为稳定，当低于5 mV时，体系不能稳定存在[24]。在贮存过程中，乳状液Zeta电位的绝对值一直处于下降趋势，其物理稳定性持续下降。在第60天，37 ℃条件下的Surfactin藻油DHA乳状液Zeta电位为（34.1±0.2）mV，4 ℃为（22.1±0.2）mV，均处于较为稳定的状态。而Tween-80-丙三醇在4 ℃、45 d和37 ℃、30 d时Zeta电位均已小于5 mV，乳状液体系变得极为不稳定。结果与乳状液粒径的测定结果基本一致，随着Zeta电位的减小，体系越来越不稳定，粒子间的排斥力减弱，粒径增大。相比较而言，Surfactin藻油DHA乳状液有着显著的热稳定性，在贮存60 d后仍能保持较好的物理稳定性。

2.3 藻油DHA乳状液的流变学性质

图5 乳状液黏度随剪切速率的变化关系Fig. 5 Viscosity versus sheer rate relationship of emulsions

由图5可知，Surfactin、Tween-80-丙三醇在剪切速率增大或减小时测定的流变曲线基本重叠，这2 种乳状液均为非触变性流体[25]。乳状液的表观黏度在剪切结束后能够迅速恢复初始表观黏度，胶束间的作用力在外力作用后迅速恢复，其粒径没有明显改变，物理稳定性也没有明显变化，即藻油DHA乳状液对外力的物理稳定性良好。

根据奥斯特瓦尔德-德沃尔幂律关系[26]，由图5计算出Surfactin藻油DHA乳状液的流动特性指数（n）为1.526、稠度系数（K）为0.137，Tween-80-丙三醇的n为1.428、K为0.314。两者n＞1，即都为胀流型流体，非牛顿流体的一种，有“剪切增稠”的特性。Surfactin藻油DHA乳状液较Tween-80-丙三醇乳状液胀流性更为显著。胀流型流体具有“湍流减阻”的性质，在狭缝中流动增强[27]。在实际应用中，这种非牛顿流体更适合在血液及组织液中流动并被吸收。关于胀流型流体的物理稳定性目前鲜有报道，但根据刘乃震[28]和Ryan[29]等的研究推论，考虑其密度相近，Surfactin藻油DHA乳状液具有更强的胀流性。由于雷诺数（Re）是流体中黏性影响的相似准则数，Re＝ρvL/μ（ρ为流体的密度，v为流场特征流速，L为流场特征长度，μ为流体动力黏性系数）[30]。考虑流体ρ、v、L相近的情况下，μ即为此状态下的动态黏度，在剪切速率相同时，Surfactin藻油DHA乳状液黏度μ较大，即此时它的Re更小，流速对乳状液流动扰动影响更小，流动更加稳定。计算发现2 种乳状液的Re在人体血管中均一定小于2 300[31]，即乳状液在血管中的流动为层流，结合“湍流减阻”的特性和Re等可以推断，Surfactin使得藻油DHA乳状液有更好的物理稳定性以及传质传热性能，这也从流变学的角度支持了Surfactin藻油DHA乳状液更为稳定的结论。

2.4 藻油DHA乳状液的氧化稳定性

图6 不同温度处理30 min后乳状液的过氧化值Fig. 6 Peroxide values of emulsions treated at different temperatures for 30 minutes

由图6可知，未经包埋的藻油DHA在37 ℃及以下氧化速率不快，30 min处理后过氧化值仅由（0.013±0.003）meq/kg增加到（0.213±0.011）meq/kg，而在更高温度条件下迅速增加，80 ℃处理30 min过氧化值上升至最大（7.419±0.025）meq/kg，是初始值的570.7 倍。处理成乳状液的藻油DHA氧化稳定性得到很大改善。Tween-80-丙三醇藻油DHA乳状液（初始过氧化值为（0.102±0.015）meq/kg）经80 ℃处理30 min后过氧化值达到（0.356±0.005） meq/kg，为初始值的3.5 倍，115 ℃、30 min达到（1.270±0.021）meq/kg，为初始值的12.5 倍。Surfactin藻油DHA乳状液（初始过氧化值为（0.115±0.009）meq/kg）80 ℃处理30 min达到（0.126±0.012）meq/kg，是初始值的1.1 倍，115 ℃、30 min达到（0.289±0.009）meq/kg，是初始值的2.5 倍。在高温条件下乳状液中由于胶束对藻油DHA分子的保护作用阻碍了氧化过程的发生，但由于高温增加了体系的能量使得乳状液体系越来越不稳定，胶束体系发生崩解。Surfactin乳状液在高温下具有更低的过氧化值，表明在高温条件下Surfactin藻油DHA乳状液液滴更为稳定，即Surfactin藻油DHA乳状液具有更好的热稳定性，从而使得DHA的氧化稳定性比Tween-80-丙三醇乳状液中更显著。

图7 不同温度下乳状液的过氧化值随贮存时间的变化Fig. 7 Peroxide values of emulsions stored at different temperatures for different times

由图7可知，在贮存过程中，由于乳状液体系的物理稳定性随时间延长而降低，胶束体系逐渐崩解使得越来越多的藻油DHA暴露于胶束外，这部分藻油DHA迅速氧化，并释放活性氧使得乳状液氧化过程加速。胶束的结构也有可能影响藻油DHA的稳定性，活性氧如果能穿过胶束也能将藻油DHA氧化。未经包埋的藻油DHA在4 ℃和37 ℃保存的第3天均已超过6.000 meq/kg，即藻油DHA在常温和低温条件下极易被氧化。在Tween-80-丙三醇形成胶束的保护下，第60天，4 ℃条件下过氧化值已达到（3.977±0.029）meq/kg，37 ℃达到（4.986±0.034）meq/kg，分别为初始值的39.0 倍和48.9 倍。Surfactin形成胶束保护下，4 ℃贮存至第60天的乳状液过氧化值为（2.519±0.219）meq/kg，37 ℃为（1.635±0.202）meq/kg，分别为初始值的21.9 倍和14.2 倍。即在4 ℃和37 ℃贮存过程中Surfactin藻油DHA乳状液的氧化稳定性比Tween-80-丙三醇藻油DHA乳状液更为显著。总体来说，Surfactin藻油DHA乳状液比藻油DHA有极大的氧化稳定性，相比Tween-80-丙三醇藻油DHA乳状液也有极为显著的提升。

3 结 论

本实验利用不同的食品级表面活性剂在不添加助表面活性剂和其他添加剂的情况下制备藻油DHA乳状液，从OD值、粒径、Zeta电位、流变学和过氧化值的角度研究极端条件和常温贮存过程中藻油DHA乳状液的物理稳定性和藻油DHA的氧化稳定性。结果发现Surfactin相比Tween-80-丙三醇及其他表面活性剂制备的藻油DHA乳状液具有非常显著的热稳定性。0.8% Surfactin溶液作为水相制备的藻油DHA乳状液在4 ℃和37 ℃贮存60 d仍能保持良好的物理稳定性，藻油DHA的氧化程度在常温保存过程和高温处理过程中也均处于较低水平，37 ℃贮存60 d过氧化值仅为（2.519±0.219）meq/kg，115 ℃处理30 min仅为（0.289±0.009）meq/kg。

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Effect of Surfactin as Surfactant on Physical and Oxidation Stability of O/W DHA-Rich Algae Oil Emulsion

HE Zhenhong, ZHAO Haizhen, LU Zhaoxin*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Surfactin was used as a surfactant to form docosahexaenoic acid (DHA)-rich algae oil emulsion. It was found that oil-in-water (O/W) DHA-rich algae oil emulsion without added cosurfactant or any other additive where the aqueous phase was 0.8% surfactin had better physical stability at 4 and 37 ℃ than emulsions formed with other surfactants. DHA-rich algae oil emulsion with surfactin had significant advantages (P ＜ 0.05) in turbidity, particle size, Zeta potential, and rheological properties than those with Tween-80-glycerol or other food-grade surfactants. Oxidation stability of DHA-rich algae oil emulsion with surfactin was also excellent after treatment at high temperature or during storage time at room temperature.The peroxide value remained at low level, which was (1.635 ± 0.202) meq/kg after storage at 37 ℃ for 60 days.

surfactin; DHA-rich algae oil emulsion; physical stability; oxidation stability

10.7506/spkx1002-6630-201721023

TS221

A

1002-6630（2017）21-0146-06

何镇宏, 赵海珍, 陆兆新. Surfactin作为表面活性剂对O/W型藻油DHA乳状液物理和氧化稳定性的影响[J]. 食品科学,2017, 38(21): 146-151.

10.7506/spkx1002-6630-201721023. http://www.spkx.net.cn

HE Zhenhong, ZHAO Haizhen, LU Zhaoxin. Effect of surfactin as surfactant on physical and oxidation stability of O/W DHA-rich algae oil emulsion[J]. Food Science, 2017, 38(21): 146-151. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721023. http://www.spkx.net.cn

2016-08-10

何镇宏（1993—），男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：2015108042@njau.edu.cn

*通信作者：陆兆新（1957—），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：fmb@njau.edu.cn