五种广东野生蕨类植物乙酰胆碱酯酶抑制活性的初步研究

丁运华，郑建灵，郭少敏

(惠州学院 生命科学系，广东 惠州516007)

五种广东野生蕨类植物乙酰胆碱酯酶抑制活性的初步研究

丁运华，郑建灵，郭少敏

(惠州学院 生命科学系，广东 惠州516007)

采用乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选模型，对五种广东野生蕨类植物的石油醚及乙酸乙酯萃取物进行乙酰胆碱酯酶抑制活性的初步研究。结果表明，石油醚萃取物中，样品浓度为10 mg/mL时，肾蕨、金毛狗和芒萁对乙酰胆碱酯酶的平均抑制率较高，分别为73.35%，67.32%，58.5%；铺地蜈蚣的平均抑制率相对较低，为32.88%左右；海金莎的抑制率为负值，对乙酰胆碱酯酶活性没有抑制，表现出一定的增强作用。样品浓度为1 mg/mL时，海金沙的平均抑制率最低，约为15.86%，其次是铺地蜈蚣，22.83%，其余四种植物均大于40%。乙酸乙酯萃取物中，样品浓度为10 mg/mL时，芒萁的平均抑制率最低，为22.74%，其余四种蕨类的抑制率均较高，都在50%以上。样品浓度为1 mg/mL时，芒萁的平均抑制率最低，为11.1%，其次是金毛狗，平均抑制率为30.9%，其余三种蕨类的抑制率均大于40%。同种植物在相同浓度时，不同溶剂萃取物对乙酰胆碱酯酶呈现不同的抑制效果。本研究为从野生蕨类植物筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂提供参考。

蕨类植物;乙酰胆碱酯酶抑制剂;乙酸乙酯萃取;石油醚萃取

阿尔茨海默氏病(Alzheimer's Disease,AD),又称早老性痴呆症,是发生在老年和老年前期的一种大脑中枢神经系统退行性病变[1]，其临床表现为渐进性记忆障碍、语言障碍、认知功能减退，并伴随行为障碍及情绪异常等，其发病率和死亡率比较高，治疗AD的问题日益严峻。目前，对于AD 的病因和发病机制广为接受的“胆碱能学说”[1-2]认为AD患者大脑中的乙酰胆碱的缺失或水平过低是导致AD的关键原因。AD的病理与患者神经间隙中乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)活性过高具有重要关系。因此乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI) 药物是目前研究最多、最为活跃的抗早老性痴呆症药物[1-5]。

广东地处亚热带与热带地区,地域辽阔,地形复杂,气候温和,雨量充沛,在不同的地域含不同的植被类型和繁多的植物种类,野生植物的种类与资源极其丰富，是开发乙酰胆碱酯酶抑制剂的宝库，有研究发现，许多海藻[1]，蕨类[4]，中草药[5]等天然植物都有乙酰胆碱酯酶抑制活性。很多蕨类植物自古以来就被广泛用于医药领域，以治疗各种疾病。如铺地蜈蚣全草有祛风散热，舒筋活血的功效；海金莎可利尿，通淋和治烫火伤；金毛狗的根茎可补肝肾、强腰膝，除风湿以及利尿等[6]。笔者选用5种广东常见的野生蕨类植物：铺地蜈蚣[Palhinhaeacernua(L.) Vas]、海金沙[Lygodiumjaponicum(Thunb.)Sw.]、金毛狗[Cibotiumbarometz(Linn.)J.Sm.]、芒萁[Dicranopterisdichotoma(Thunb.)Bernh.]、肾蕨[Nephrolepisauriculate(L.) Trimen]，对这5种野生蕨类植物的石油醚萃取物及乙酸乙酯萃取物进行乙酰胆碱酯酶抑制活性进行研究，旨在为发现天然的乙酰胆碱酯酶抑制剂提供线索以及对它们的进一步药用价值研究提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

铺地蜈蚣、海金沙、金毛狗、芒萁、肾蕨采集于广东惠州、河源地区的山地，经惠州学院生命科学学院林芳花副教授鉴定。

1.2 试剂与仪器

底物碘化硫代乙酰胆碱(ATCI) 和显色剂二硫代双对硝基苯甲酸(DTNB)均购于国药集团化学试剂有限公司，乙酰胆碱酯酶购于Sigma公司,配制方法是10 mg酶加入1 mg牛血清白蛋白作为稳定剂，用50 mmol/L，pH8.0的PBS溶液1 mL制成2 U/mL的酶液)，他克林(tacrine)购于Sigma公司，配制时用50 mmol/L，pH8.0的PBS溶液配制，其余试剂为国产分析纯或生化试剂规格.

DZF-6020型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司),BJ-350型高速多功能粉碎机,SB3200DT超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有新公司),抽滤机(郑州长城科工贸有限公司),RE2000A旋转蒸发器(上海一科仪器有限公司),722G可见分光光度计,HWS24型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)。

1.3 蕨类植物样品的制备

将采集的5种新鲜蕨类植物全草阴干或烘干后粉碎,取每种粉碎样品各10 g,用100 mL 95%乙醇溶解,50 ℃超声波提取30 min,过滤,连续提取3次,合并提取液；减压蒸馏后得乙醇提取物浸膏,加入100 mL蒸馏水浸泡溶解，依次用石油醚(100 mL ×3)、乙酸乙酯(100 mL ×3)分别萃取3次，合并提取液，减压蒸馏，分别获得相应的石油醚浸膏和乙酸乙酯组分。用50%乙醇分别配成10 mg/mL和1 mg/mL浓度的样品溶液备用[1,7-8]。

1.4 筛选模型的建立

参照Ellman的方法稍作改进[1,8-9]。改法的原理为AChE催化水解底物碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)，水解形成的产物碘化硫代胆碱迅速与显色剂二硫代双硝基苯甲酸(DTNB)反应生成黄色产物5-巯基-2硝基苯甲酸，该产物在412nm处有光吸收。在酶催反应的稳态阶段用光吸收值OD值表征酶促反应初速度.

1.4.1 OD-T曲线的测定

取50 mmol/L的 PBS 2 730 μL，37℃水浴预热2 min，再依次加入乙酰胆碱酯酶 13 μL，15 mmol/L 的 DTNB 100 μL，15 mmol/L 的ATCI 100 μl，37℃水浴反应不同时间(0 min,5 min，10 min，15 min,20 min，25 min，30 min)，测其在412 nm 处的OD 值。(扣除ATCI因非酶催水解所产生的吸光值)，确定酶催反应处于初速度的时间。

1.4.2 OD-酶活曲线的测定

取50 mmol/L 的 PBS 2 730 μL，37℃水浴预热2 min，再依次加入不同浓度(0.8 U/mL，1.2 U/mL，1.6 U/mL,2.0 U/mL,2.4 U/mL,2.8 U/mL)的乙酰胆碱酯酶13 μL,15 mmol/L的DTNB 100 μL,15 mmol/L的ATCI 100 μL,37℃水浴反应的时间由1.4.1的实验确定，测其在412 nm 处的OD 值。(扣除ATCI因非酶催水解所产生的吸光值)，确定是否可以用OD值代表酶活。

1.4.3 活性测定及计算

取2 630 μL 50 mmol/L的 PBS，37 ℃预热2 min，再依次加入样品100 μL，乙酰胆碱酯酶13 μL,15 mmol/L 的DTNB 100 μL，15 mmol/L 的 ATCI 100 μL，37℃水浴反应 20 min，加入100 μL 1%的SDS终止反应，测其在412 nm的OD值，记为A样品。

由于本实验五种野生蕨类植物的乙醇提取物样品本身多有颜色，所以每个样品同时做一个本底扣除，在上面的测定中，用100 μL 50 mmol/L 的 PBS 代替底物溶液，测其 412 nm 的 OD值，记为 A本底。

空白对照，即用100 μL PBS来代替样品，测其 412 nm 的 OD 值，记为 A空白。

阳性对照：测定方法同A样品，反应体系中用100 μL的他克林代替样品溶液。

吸光值和抑制率的计算公式为：

样品的吸光值为：A真实=A样品-A本底

样品的抑制率为：(A空白-A真实)/A空白×100%

所有实验重复3次并计算平均值和标准偏差。

2 结果与讨论

2.1 筛选模型

2.1.1 ATCI非酶水解的光吸收

底物ATCI会有一定的非酶催水解作用。15 mmol/L 的 ATCI 100 μL加入 2 730 μL 50 mmol/L 的 PBS，15 mmol/L 的 DTNB 100 μL，不加酶，37℃水浴反应不同时间，通过测412 nm 时的OD 值可以明显见到随着水浴时间的延长，吸光值缓慢而持续增高，所以ATCI的吸光值不可忽略。

图1 ATCI的光吸收曲线

2.1.2 OD-t曲线的测定

反应开始后20 min内，在实验选取的几个时间点，OD值与时间呈现较好的线性关系，20 min后，吸光值开始下降。因此取20 min作为该反应体系的反应时间，反应开始后20 min内的OD值都可以代表其反应初速度。

图2 OD-t曲线

2.1.3 OD-酶活曲线

由图3的结果可看出，在20 min时、0.8～2.8 U/mL的酶浓度下，OD值与酶浓度形成较好的线性关系，证明在此范围内可用OD值来表示酶活。

图3 OD-酶活曲线

2.2蕨类植物的活性测试结果

表1 五种药用蕨类植物的活性测试结果(平均抑制率)

注：他克林阳性对照浓度为3.13×10-9mg/mL时的抑制率为(63.8±4.15)%

根据表1的结果显示，五种药用蕨类植物的石油醚萃取物及乙酸乙酯萃取物在样品浓度不同的情况下，对乙酰胆碱酯酶活性的抑制程度也就不同。

石油醚萃取物样品浓度为10 mg/mL时，肾蕨、金毛狗和芒萁三种蕨类表现出较高的抑制活性。其中肾蕨的平均抑制率最大，为73.35%，其次是金毛狗，平均抑制率为67.32%，芒萁的平均抑制率为58.5%，铺地蜈蚣的抑制率相对较低，为32.88%,海金沙的平均抑制率为-20.56%，表明它的石油醚萃取物在浓度为10 mg/mL的情况下不仅对乙酰胆碱酯酶活性没有抑制，反而有一定的增强作用。当样品浓度为1 mg/mL时，海金沙的平均抑制率最低，只有15.86%，其余四种蕨类植物均大于20%，金毛狗、芒萁和肾蕨的平均抑制率都在40%以上。

乙酸乙酯萃取物的样品浓度为10 mg/mL时，肾蕨、铺地蜈蚣、海金沙和金毛狗四种蕨类植物的平均抑制率都较高，均在60%左右，只有芒萁较低，平均抑制率仅有22.74%。当样品浓度为1 mg/mL时，肾蕨、铺地蜈蚣和海金沙三种蕨类植物的平均抑制率较高，大于40%，金毛狗的平均抑制率为30.90%，芒萁的平均抑制率最低，只有11.1%。乙酸乙酯萃取物组分没有出现平均抑制率为负值的情况。

从表1测定结果还发现，同种药用蕨类植物在相同浓度的情况下，不同溶剂的萃取物对乙酰胆碱酯酶的活性呈现出不同的抑制效果。铺地蜈蚣和海金沙在样品浓度为10 mg/mL和1 mg/mL时的平均抑制率，均为乙酸乙酯萃取物大于石油醚萃取物；金毛狗和芒萁则与之相反，在样品浓度为10 mg/mL和1 mg/mL时的平均抑制率，均是石油醚萃取物大于乙酸乙酯萃取物；肾蕨则与其他四种蕨类植物的情况不同，其浓度为10 mg/mL时，石油醚萃取物的抑制率大于乙酸乙酯萃取物，而其浓度为1 mg/mL时的抑制率，则是乙酸乙酯萃取物大于石油醚萃取物。

3 讨 论

五种广东乡土蕨类植物乙醇提取物的石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物对乙酰胆碱酯酶都呈现出一定的抑制作用。比较特殊的是，海金莎的石油醚萃取物样品浓度为10 mg/mL时，其抑制率是负值，也就是说此时它不仅对乙酰胆碱酯酶活性无抑制作用，反而有一定的增强作用，而在其他浓度或其他萃取物中，抑制率则为正值。针对海金莎的双向抑制效果，剂量应该是影响因素之一。即同一味药随着剂量的变化，功效也会发生变化。测定结果中同种药用蕨类植物在相同浓度的情况下，不同溶剂的萃取物对乙酰胆碱酯酶的活性呈现出不同的抑制效果的情况，可能与不同的提取方法得到的化合物种类及含量不同有关。乙酸乙酯提取物类型多为甾醇、萜类、黄酮类，芳酸酯、酚类等，挥发油成分含量很少，石油醚组分多为脂溶性成分：脂肪酸、甘油酯、长链烃类化合物以及萜类、甾体、生物碱等[10-12]。对不同提取物中的化合物成分进行更加系统深入的化学成分结构鉴定研究，将很可能发现活性强的有效成分，从而为可治疗早老性痴呆的药物开发及研究提供更有价值的活性先导结构

很多蕨类植物自古以来就被广泛的用于医药上，其含有黄酮类、甾类、生物碱、酚类、三萜类化合物等多种活性物质，对很多疾病都有较明显的治疗效果。本实验也表明这五种药用蕨类植物基本都对乙酰胆碱酯酶有一定的抑制作用，即这些植物里面极可能含有抑制AChE活性的成分。因此，对这些植物作进一步活性追踪、化学成分分离和结构鉴定将是今后努力的方向。

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StudiesofAcetylcholinesteraseInhibitoryActivitiesofFiveWildFernsExtractsinGuangdong

Ding Yunhua,Zheng Jianling,Guo Shaomin

(School of Life Science,Huizhou University,Huizhou 516007,China)

To research the acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activity of five ferns extracts which were collected from Guangdong province,screening model of acetylcholinesterase inhibitory activity were used.The results showed that at 10 mg/mL of petroleum ether extract,Nephrolepisauriculate,CibotiumbarometzandDicranopterisdichotomademonstrated higher inhibitory activity,which were 73.35%，67.32%，58.5% respectively.Lower inhibitory activity was seen inPalhinhaeacernuaand negative inhibitory activity inLygodiumjaponicum; At 1 mg/mL of petroleum ether extract,Lygodiumjaponicumshowed the lowest inhibitory activity,which was 15.86%,andPalhinhaeacernuacame next with 22.83%,and the remaining four ferns were all above 40%.At 10 mg/mL of ethyl acetate extract,Dicranopterisdichotomawas seen with the lowest inhibitory activity,which was 22.74%,while the remaining four ferns were all above 50%; at 1 mg/mL of ethyl acetate extract,Dicranopterisdichotomawas still seen with the lowest inhibitory activity,which was 11.1%,andCibotiumbarometzcame next with 30.9%,the remaining three ferns were all above 40%.Different solvent extracts showed different inhibitory activity at the same concentration with the same fern plant.

fern phant ; acetylcholinesterase inhibitor; ethyl acetate extract; petroleum ether extract

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.05.004

2017-03-28

广东省科技计划项目(2011B030800021)；惠州市科技计划项目(2012P16)。

丁运华(1966—)，女，副教授，研究方向：植物生物技术与天然产物研究。E-mail：dingyunhua@hzu.edu.cn

Q949.95

A

1006-9690(2017)05-0017-04