一例人感染带绦虫PCR鉴定

蔡亚南 ， 赵丽娟 ， 王 丞 ， 祝学珍 ， 唐 磊 ， 杨桂连 ， 钱爱东 ， 赵 权

(吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林 长春 130118)

一例人感染带绦虫PCR鉴定

蔡亚南 ， 赵丽娟 ， 王 丞 ， 祝学珍 ， 唐 磊 ， 杨桂连 ， 钱爱东 ， 赵 权

(吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林 长春 130118)

为了快速鉴别诊断一例人绦虫感染病例，采用聚合酶链式法(PCR)扩增线粒体cox1和Cytb基因片段，对PCR 扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳检测和基因序列测序。分别与NCBI 数据库中带绦虫cox1 和Cytb基因序列进行比对，同时选用MEGA 构建系统进化树。结果：核酸序列与NCBI 数据库中牛带绦虫同源性均为99%，进化分析表明与牛带绦虫的亲缘性最近。表明该病例属于牛带绦虫感染。

牛带绦虫 ；cox1 ；Cytb； 鉴定

牛带绦虫(Taeniasaginata.Tsa)、亚洲带绦虫(Taeniaasiatica.Tas)和猪带绦虫(Taeniasolium.Ts)均可感染人，且从临床症状和虫体形态上难以区分。为了鉴定该病人所患虫种，本文通过PCR方法扩增cox1和Cytb基因片段，并对扩增序列进行分析及构建进化树，从而确定该绦虫种属，进而确定该例患者的病源。

1 材料与方法

1.1 病料来源 2016年8月广西某地一位患者，常常表现腹痛、腹部不适现象，并且伴有体重下降，肛门瘙痒症状，粪便中偶见乳黄色的的绦虫节片，患病前常吃生肉片和烧烤，疑似患有囊虫病，来吉林农业大学囊虫病医院就诊。给病人口服中药合剂(新鲜南瓜子和槟榔提取物)，30 min后口服30%水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)。经过3～6 h排出大约1m长近乎完整的绦虫。置于0.9%生理盐水中保存，检测。

1.2 绦虫基因组提取 取0.5g绦虫孕卵节片，经液氮充分研磨，采用TaKaRa基因组DNA广谱型小量纯化试剂盒，按照说明书，提取绦虫基因组。

1.3 引物设计及克隆 根据GenBank上cox1和Cytb基因序列，设计特异性引物，见表1。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 cox1和Cytb引物

PCR反应体系 2X PremixTaq(TaKaRa, Japan)25 μL,去离子水20 μL, Primer-F(10 μmol/L)1.5 μl,Primer-R(10 μmol/L)1.5 μL,模板(gDNA)2 μL,总体积50 μL。PCR 反应条件：预变性95 ℃，5 min；变性94 ℃，40 s；退火55 ℃，40 s；延伸72 ℃，1 min；再延伸72 ℃，10 min。循环数：35 cycles。取2 μL PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，若条带正确，将剩余PCR产物回收。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，纯化(TaKaRa MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0)，取4 μL纯化产物连接到1 μL的PMD-18T(pMDTM18-T Vector Cloning Kit)载体中。转化到DH5α(Tiangen)感受态中，在含有Amp+抗性的LB固体培养基上，37 ℃培养12～16 h。挑取单克隆菌落在含有抗性的液体LB培养基内，37 ℃，180 r/min振荡培养12～16 h，取5 ml菌液提取质粒。以质粒作为模板按以上PCR条件验证，由上海生工生物工程技术服务有限公司完成测序。

1.4 测序结果比对 对该绦虫所测核苷酸序列通过NCBI(National Center for Biotechnology Information) Blast(Basic Local Alignment Search Tool)工具比对其同源性。

1.5 构建进化树 GenBank上分别下载牛带绦虫、猪带绦虫、亚洲带绦虫的cox1和Cytb序列。cox1共15条核苷酸序列，Cytb共10条核苷酸序列。将测序成功的基因片段分别与GenBank上绦虫线粒体cox1和Cytb核苷酸序列对比，并使用MEGA(Version6)软件，采用邻接法(Neighbor-joining NJ)、选用Kimura 2-parameter模式，Bootstrap值设定为 1 000 bp 构建绦虫系统进化树。

2 试验结果

2.1 虫体有绦虫孕节。

2.2 琼脂糖凝胶电泳 PCR产物经1%琼脂糖凝胶检测，如图1可见，cox1在接近2 000 bp的位置、Cytb在靠近1 000 bp的位置有明显单一的条带。

图1 cox1和Cytb序列PCR结果

M：DL-2 000 DNA Marker； 1：cox1； 2：cox1阴性对照； 3：Cytb； 4：Cytb阴性对照

2.3 核酸序列比对结果cox1 核苷酸序列长度为1 620 bp，通过NCBI Blast 显示分别与牛带绦虫(GenBank: AB107244)同源性为99%，突变碱基3个，见表2；亚洲带绦虫(GenBank: AB107235.1)同源性为96%，突变基因66个；猪带绦虫(GenBank: JX535570.1)同源性为92%。Cytb核苷酸序列长度为1 068 bp，NCBI Blast 显示分别与牛带绦虫(GenBank: AB274525.1)同源性为99%，不同碱基8个，见表2；亚洲带绦虫(GenBank:AB066580.1)同源性为97%，不同和缺失碱基共35个；猪带绦虫(GenBank: FN995661.1)同源性为87%。

2.4 核苷酸序列比对并构建系统进化树 采用MEGA 构建的绦虫cox1 和Cytb进化树见图3和图4，待测绦虫(Tapeworm)与牛带绦虫形成一个单系，亲缘关系最近。

表2 基因cox1和Cytb突变碱基

图2 cox1基因核苷酸序列进化树

图3 Cytb基因序列进化树

3 讨论

绦虫病是世界卫生组织(WHO)公认的热带病，常用的诊断方法有：虫体形态学检查、血清抗体ELISA检测、分子生物学鉴定。传统的虫种鉴定主要依据虫体的形态，比如头节上有无顶图和钩，链体长度，卵巢形态和睾丸长度等。但牛带绦虫和亚洲带绦虫形态极其相似，并且部分地区还有绦虫与蛲虫混合感染的现象，所表现的症状与急性阑尾炎相似[1]。常用的分子生物学技术有多重PCR、RFLP-PCR、随机引物DNA扩增等[3]。寄生虫分子学特征的研究是学习和控制寄生虫的流行病学和传染的关键因素。近几年对寄生虫基因的研究颇多，例如全基因组测序[2]、线粒体遗传变异[3]等。

线粒体基因组作为分子标记被广泛应用于物种鉴定[4-6]，为流行病学的研究提供来源。Cytb与cox1在不同种属之间具有较高的保守性和特异性，可准确、高效地评估种间或种内的遗传变异及其亲缘关系[7]。cox1和Cytb完整序列的分析显示,全世界存在两个绦虫系谱：亚洲组和非洲或拉丁美洲组，即使绦虫因不同地理位置的改变而发生的遗传变异也可准确鉴定绦虫病[4]，结合系统发育树可描述物种间的进化关系，并推断出物种之间的遗传距离[5]。陈铮宏等[6]、张晨昊等[7]和罗浪等[8]以cox1和mtDNA-Cytb作为基因标记，采集大理、怒江和台湾等部分地区带绦虫标本，并成功鉴定了其种属。本文早在20世纪末，就有学者[9; 10]针对采集台湾地区的绦虫进行了基因分析，提出并验证了亚洲带绦虫可能是牛带绦虫的一个亚种，王正蓉[11]并对此提议进行了验证，认为将亚洲带绦虫划分为牛带绦虫亚种较为合适。

本文选用线粒体cox1和Cytb基因序列作为分子遗传标记， PCR扩增阳性结果经测序发现序列长度与GenBank数据库上记录的cox1和Cytb序列长度一致，分别是为1 620 bp和1 068 bp。Blast比对显示：与牛带绦虫同源性最高99%。进化树分析可知，序列分别与牛带绦虫cox1和Cytb基因同属于一个分支，并且Cytb序列与蒙古Cytb序列并为一支，同为亚洲地区。经以上分子生物学信息分析，证明该虫种与牛带绦虫为一个种，属于亚洲组。

本文绦虫线粒体基因组系统拓扑结构显示，被检绦虫与亚洲带绦虫构成姊妹支,与牛带绦虫隶属于一个分支，与牛带绦虫亲缘关系最近。与以往试验数据相一致，进一步证实该绦虫属牛带绦虫。在我国一些贫困地区由于卫生条件差、设施缺乏，仍然存在人畜厕所不分的现象，且部分少数民族地区依然保留着吃生肉片和烧烤的习俗，给囊尾蚴病的传播创造了有利条件[12]。及时控制和预防绦虫病的传播有利于各地区畜牧业的发展和经济的提高，建议加强公共卫生知识的学习、改正不良饮食习惯、切断中间宿主的传播，来控制和预防绦虫的传播。

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B

0529-6005(2017)09-0097-03

2017-04-06

中国博士后科学基金面上项目(2014M561308)；吉林省科技厅项目(20160520180JH，20170307016NY)；吉林省教育厅项目(2016193)

蔡亚南(1980-)，男，讲师，博士，主要研究方向为中草药抗寄生虫病研究， E-mail：caiyanan@jlau.edu.cn

赵丽娟(1992-)，女，硕士生，主要研究方向为动物寄生虫病学， E-mail：1005676023@qq.com

注：赵丽娟和蔡亚南对本文具有同等贡献

赵权， E-mail：zhaoquan0825@163.com