病证结合帕金森病小鼠模型的构建

梁建庆 何建成

(甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州 730000)

1 上海中医药大学基础医学院

病证结合帕金森病小鼠模型的构建

梁建庆 何建成1

(甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州 730000)

目的建立一种稳定的、可操作性强的病证结合帕金森病(PD)小鼠模型。方法采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)腹腔注射法构建PD动物模型，同时设立正常对照组、复方地黄方组，从病因、症状、客观指标、药物反证等方面对PD小鼠模型进行综合判断，验证该模型的中医证候属性。结果模型组行为学、氧化应激、酪氨羟化酶(TH)mRNA及蛋白等指标与正常对照组差异显著(P<0.01)。复方地黄方组可明显改善PD小鼠的主观症状和客观指标(P<0.01)。结论MPTP腹腔注射法制作的PD模型中医证候属性是阴虚动风证。

病证结合；动物模型；帕金森病

在帕金森病(PD)的研究领域，缺乏病证结合动物模型的支撑阻碍了中医中药的干预研究。本研究拟构建病证结合小鼠PD模型。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 C57/BL6小鼠，雌性,体重(21.10±2.01)g，共48只，由上海中医药大学实验动物中心提供，许可证号码：SCXK(沪)2008-0016。SPF级饲养。实验动物共分为正常对照组、模型组、复方地黄方组，每组16只。

1.2药物和试剂 复方地黄方药物组成：熟地20 g、白芍30 g、钩藤15 g、珍珠母15 g，采用水煎法将药液浓缩至0.59 g(生药量)/0.4 ml,相当于成人用量的2倍，4℃冰箱保存备用，由上海中医药大学中药制剂实验室提供。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP，Lot#SLBC4446V)为Sigma公司产品。考马斯亮蓝法蛋白定量测试盒(批号：20140520)、丙二醛(MDA，批号：20140531)、谷胱甘肽(GSH，批号：20140520)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px，批号：20140516)、超氧化物歧化酶(SOD，批号：20140518)检测试剂盒,购自南京建成生物工程研究所。总RNA提取(Trizol，批号：SK1312)、AMV First Strand cDNA合成酶试剂盒(批号：SK2445),购自生工生物工程上海(股份)有限公司。抗酪氨酸羟化酶〔EP1533Y〕抗体(批号：ab75875),购自美国Abcam公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG二抗(批号：HA1001),购自杭州华安生物技术有限公司。

1.3实验仪器 多功能酶标仪：Biotek Synergy 2，基因有限公司。荧光定量PCR仪：ABI 7500型，美国应用生物系统中国公司。电热恒温水浴箱：HHS-1,上海跃进医疗器械厂。高速冷冻离心机：GTR16-2，Beckman公司。化学发光成像系统：FC-M型，美国ProteinSimple。Western电泳仪：043BR41664，美国Bio-Rad公司。脱色摇床：TS-1型，江苏海门市其林贝尔仪器有限公司。恒温磁力搅拌器：81-2型，上海司乐仪器有限公司。超细匀浆机：F6/10，Fluko(上海弗鲁克流体机械制造有限公司)。移液器：Eppendorf公司。

1.4病证结合模型制备 48只C57/BL6小鼠，其中16只为正常对照组，其余32只参与模型制备，给MPTP 30 mg/kg腹腔注射，每日1次，连续注射5 d；予正常对照组腹腔注射等量生理盐水〔1〕。造模共成功32只，采用随机数字表法将32只小鼠分为模型组、复方地黄方组。复方地黄方组予复方地黄方灌胃(0.2 ml/10 g)；正常对照组、模型组予生理盐水灌胃(0.2 ml/10 g)。每日1次，连续治疗14 d。小鼠在最后一次行为学评价后断头处死，在冰上分离左右黑质，-80℃冰箱保存。本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.5病证结合动物模型的诊断标准 根据《中医内科学》中描述的颤震的证候表现及西医诊断标准确定〔2,3〕。

1.6行为学评价 各组小鼠于实验前4 d每天进行2次爬杆、悬挂、游泳行为训练。在给药期间到处死动物前，每天于注射MPTP后或给药后2 h，分别进行爬杆、悬挂、游泳的行为检测，连续19 d，观察小鼠肢体运动功能的变化〔4,5〕。具体方法及评分标准：①爬杆实验。制作一个直径1 cm,长50 cm的铁杆,缠上纱布以增加摩擦,将杆竖直放置,然后将小鼠头朝下放置于杆顶,记录小鼠从杆顶爬至杆底所用的时间。②悬挂实验。小鼠用两前爪悬挂在一水平金属线上(直径1 mm,距地面30 cm),记录悬挂时间及动作。两后爪都抓金属线3分,一后爪抓2分,两后爪都不抓1分,30 s内跌落0分,依动作迟缓酌情加减0.5分。③游泳实验。将受试小鼠放入一个20 cm×30 cm×20 cm 规格的水箱中,水温32℃～35℃。在受试时间(10 min)内能连续不断游泳者计3分,大部分时间游泳偶尔漂浮者计2.5分,漂浮占50%以上者计2分,偶尔游泳者计1.5分,偶尔用后肢游动并漂浮在一边者计1分。

1.7氧化应激 取小鼠黑质,制备脑组织匀浆液，检测黑质中MDA、GSH、GSH-Px、SOD含量。按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书步骤进行操作。

1.8TH mRNA 取小鼠黑质，提取总RNA，合成cDNA模板，进行荧光定量PCR反应。TH引物序列(Primer Premier 5.0软件设计)：正向：5'-GGACGGCGACAG AGTCTCAT-3'，反向：5'-AGCTTCCGACGCTGGCGATA-3'，扩增片段为512 bp。引物β-actin:正向：5'-TGTCCCTGTATGCCTCTGGT-3'，反向：5'-TTGATGTCACGCACGATTTC-3'，扩增片段为217 bp。PCR扩增条件为94℃预变性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃延伸7 min。相对定量2-△△Ct法分析各样本目的基因。

1.9TH蛋白 取小鼠黑质，Western印迹法检测TH蛋白表达。检测步骤是：蛋白质抽提、BCA法蛋白浓度测定、电泳、半干转膜、免疫反应、化学发光法显影，用AlphaView 图像分析软件对扫描图像的目标条带进行灰度分析，各目的条带与β-actin的灰度值比值为目的蛋白的相对表达量。

1.10统计学方法 用SPSS18.0软件进行t检验、方差分析及χ2检验。

2 结 果

2.1各组行为学变化 与正常对照组比较，模型组出现不同程度的肢体运动协调能力下降，爬杆、悬挂及游泳实验指标均存在显著差异(P<0.01)；与模型组比较复方地黄方组，可明显改善各指标(P<0.01)。见表1。

表1 各组行为学变化

与正常对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01，下表同

2.2各组氧化应激指标变化 与正常对照组比较，模型组MDA明显升高，GSH、GSH-Px、SOD明显下降(P<0.01)；与模型组比较，复方地黄方组MDA、GSH、GSH-Px、SOD均显著改善(P<0.01)。见表2。

表2 各组氧化应激指标、TH mRNA及蛋白变化

2.3各组TH mRNA及蛋白变化 与正常对照组相比，模型组TH mRNA及蛋白明显下降(P<0.01)；与模型组比较，复方地黄方组可明显改善TH mRNA及蛋白的表达(P<0.01)。见表2。

2.4各组TH 蛋白变化 与正常对照组相比，模型组TH 蛋白明显下降(P<0.01)；复方地黄方组与模型组比较可明显改善TH 蛋白的表达(P<0.01)，见表2，图1。

图1 各组黑质TH蛋白Western印迹

3 讨 论

1983年，Langston报道了人类因一种不完全合成的海洛因中毒后，产生了严重的PD临床表现。后来研究者证明这种药物的化学成分是MPTP。1986年Bankiewicz等给猴一侧颈动脉内注入MPTP，只摧毁同侧半球的黑质，研发出了一种半侧PD动物模型，每只模型猴都有一个作为对照的未损伤半球和一个同体的用来测试的损伤半球，实现在一只猴子身上既能测试，又有对照〔6〕。这个模型对PD的实验研究极为有用。现已证实MPTP是一种针对多巴胺(DA)能神经元的神经毒素，对MPTP敏感的动物除灵长类外,啮齿类特别是某些种属的小鼠,如C57BL/6,能够复制出大部分PD生化及病理损害特征,至今仍是PD研究的首选动物模型之一。MPTP有高度的脂溶性，容易透过血脑屏障，进入脑组织后被胶质细胞中的酸性细胞器捕获,在单胺氧化酶(MAO)-B作用下转化为离子化的甲基-苯基-双氢吡啶(MPDP)，进一步转化为甲基-苯基吡啶离子(MPP+),由DA转运体载入DA能神经元胞体内，再进入线粒体，抑制线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性，使三磷酸腺苷(ATP)合成减少，自由基生成增加，使细胞内乳酸堆积、Ca2+平衡紊乱、一氧化氮(NO)合成增加、GSH合成减少，这些因素均可增加自由基的大量生成，削弱细胞对自由基损伤的抵抗能力，最终导致DA能神经元变性死亡〔7〕。

按照病证结合动物模型的诊断标准，对照模型组小鼠的临床症状，我们可以推断PD模型小鼠的证候属性。每次给小鼠腹腔注射MPTP后数分钟至半小时，可出现全身抖动、肌肉震颤、竖毛、竖尾征(即尾巴强直上翘)、牙齿颤动、烦躁乱动等症状，类似PD患者震颤、肌强直等症状，西医理论认为此种震颤可能与基底节功能受损有关。客观指标,小鼠毛发干枯，大便干燥呈颗粒状，小便量少色黄，显微舌象是红舌。平均每只小鼠饮水量10 ml/24 h。综合症状体征，中医解释为药邪(MPTP)内侵，斫伤肝肾阴液，继发水亏火旺，阴不敛阳，筋膜失养，虚风内动，证明该模型的证候属性是阴虚动风证，相当于西医的PD。

研究证明，DA能神经元含有神经递质DA，DA在代谢过程中会产生氧自由基(OFR)，容易使DA能神经元处于氧化应激状态，极易产生氧化损伤〔8〕。TH是DA合成的限速酶，TH蛋白由两部分构成，N端为调节区域，C端为催化活性区，其所有的活性催化残基都位于其C-端的330个氨基酸中〔9〕。如前所述，TH在DA的合成调节中发挥着重要作用。在人体内，一部分DA存在于黑质纹状体系统中，当TH的质或量发生变化都会干扰L-DOPA的生物合成，导致PD的发生〔10〕。这就表明，PD患者处于氧化应激状态，TH表达量显著减少为该病的显著特征。

复方地黄方由熟地黄、白芍、钩藤、珍珠母组成，方中熟地性温味甘，归肝肾经，善补益肾精、滋阴养血、固本培元，故为君药。白芍性味苦酸微寒，归肝脾经，养肝血、滋肝阴、柔肝气，为养血濡筋、缓急止颤之良药，为臣药。钩藤甘凉，入肝心经，功效熄风定惊，为佐药。珍珠母性味咸寒，归肝心经，可滋阴潜阳、定惊止颤、养血舒筋，柔肝与熄风两者兼顾，滋阴与养血并疗，乃平肝潜阳之要药，为使药。上述诸药合用，可补益肝肾、滋阴熄风。根据“方证相应，以方测证”的理论，复方地黄方的适应证应是阴虚动风证。药物反证,复方地黄方灌胃后PD小鼠的临床症状及客观指标明显改善。以方测证，MPTP小鼠PD模型的中医证候属性是阴虚动风证。

上世纪60年代邝安堃教授发现过量肾上腺皮质激素可诱发小鼠呈现类似中医阳虚症状以来，证候动物模型的探索已逾50年〔11〕。本文所建病证结合动物模型具有疾病和证候的双重特征，为PD动物模型首次提供了证候物质基础。通过以方测证，进一步证实该模型的合理性，填补了这一研究领域的空白。

1梁建庆.阴虚动风证帕金森病模型鼠神经营养因子与神经递质表达的变化及复方地黄制剂的干预作用〔D〕.上海:上海中医药大学基础医学院,2015.

2田德禄.中医内科学〔M〕.北京:人民卫生出版社,2003:299.

3王维治.神经病学〔M〕.北京:人民卫生出版社,2002:207-9.

4Haobam R,Sindhu KM,Chandra G,etal.Swim-test as a function of motor impairment in MPTP model of Parkinson's disease:a comparative study in two mouse strains〔J〕.Behav Brain Res,2005;163(2):159.

5Mori A,Ohashi S,Nakai M,etal.Neural mechanisms underlying motor dysfunction as detected by the tail suspension test in MPTP-treated C57BL/6 mice〔J〕.Neurosci Res,2005；51(3):265.

6齐建国.神经科学扩展〔M〕.北京：人民卫生出版社，2011：452-3.

7陈生弟.帕金森病〔M〕.北京：人民卫生出版社，2006：119-20.

8王光辉.多巴胺能神经元线粒体的氧化损伤与帕金森病〔J〕.生命的化学,2014;34(2):193-9.

9吴少平.酪氨酸羟化酶及其活性片段在帕金森病中的作用〔D〕.北京：中国人民解放军军事医学科学院,2006.

10张赫楠,李 平,白芳芳，等.酪氨酸羟化酶的研究进展〔J〕.国际病理科学与临床杂志,2013;33(5):449-52.

11魏 盛,孙 鹏,张惠云.证候动物模型质量考核的思路与方法〔J〕.中华中医药杂志,2012;27(10):2607-10.

EstablishmentofamicemodelofParkinson'sdiseasewithcombinationofdiseaseandsyndromeforpreliminarystudy

LIANGJian-Qing,HEJian-Cheng.

SchoolofBasicMedicine,GansuUniversityofTCM，Lanzhou730000,Gansu,China

ObjectiveTo establish of a steady and simplify operation mice model of Parkinson's disease(PD) with combination of disease and syndrome,in order to meet the demand of study medication on treatment of PD evaluation.MethodsThe animal model of PD had been induced by intraperitoneal injection of MPTP.At the same time normal control,compound rehmannia prescription groups were set up to estimate PD model from the etiology,symptoms,objective index,drugs prove therapy,in order to investigate the syndrome properties of this mice model.ResultsThere were statistically significant differences in behavior,oxidative stress,TH mRNA and protein between model and normal control groups(P<0.01).Compound rehmannia prescription group could significantly improve the subjective symptoms and objective indexes(P<0.01).ConclusionsThe syndrome property of PD mice model induced by intraperitoneal injection of MPTP is mainly Yin Xu Dong Feng Zheng.

The combination of disease and syndrome；Animal model；Parkinson's disease

国家自然科学基金(No.81573899,No.81670767)；上海市科委新药开发研究项目(No.12401900302)；甘肃中医药大学中青年科研基金(No.ZQ2015-17)；敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室开放课题(No.DHYX151608)

何建成(1966-)，男，教授，博士生导师，主要从事中药治疗帕金森病研究。

梁建庆(1976-)，男，副教授，在读博士后，主要从事中医证候动物模型研究。

R742

A

1005-9202(2017)20-4961-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.003

〔2016-11-17修回〕

(编辑 曹梦园)