基于谱效关系的钩吻炮制减毒存效的实验研究

吴水生,李德森，许豪然，廖华军*，陈亮，李丹

(1.福建中医药大学,福建 福州 350122;2.马来西亚北马中医药学院，马来西亚 槟城 13200;3.福建中医药大学附属福州市中医院,福建 福州 350001)

制剂工艺

基于谱效关系的钩吻炮制减毒存效的实验研究

吴水生1,李德森1，许豪然2，廖华军1*，陈亮3，李丹3

(1.福建中医药大学,福建 福州 350122;2.马来西亚北马中医药学院，马来西亚 槟城 13200;3.福建中医药大学附属福州市中医院,福建 福州 350001)

目的:研究砂炒钩吻的减毒存效的工艺及镇痛药效。方法:采用烘烤箱高温加热法，以镇痛药效、急性毒性为评价指标，在单因素试验基础上，选择炮制时间、炮制温度为自变量，采用星点设计-响应面法优选钩吻炮制工艺的研究。结果:钩吻在190～230℃温度下，经过10～60 min的炮制后，毒性明显降低，且保留一定的镇痛效应。对炮制品的外观、毒性和镇痛药效综合考虑，在炮制温度200～220℃，炮制时间在10～20 min内进行最佳工艺优选，得到钩吻的最佳炮制工艺：炮制温度210℃，炮制时间15 min。在此条件下进行验证性实验，结果与实验预测值较为接近，说明采用响应面法得到的工艺参数可靠，具有一定的实用价值。结论:砂炒钩吻炮制后毒性明显降低，同时又保留良好的镇痛药效，取得了良好的预期结果。

钩吻；炮制；减毒存效；星点设计-响应面法

钩吻(GelsemiumelegansBenth.)又名断肠草、野葛、毒根、大茶药，是马钱科( Loganiaceae)植物胡蔓藤属( Gelsemium)的全株，是世界著名的剧毒植物，主要分布在我国福建、湖南、浙江、广东、贵州、广西、云南等地[1]，首载于《神农本草经》，列为下品，谓其“主金疮，乳痓，中恶风，咳逆上气，水肿，杀鬼疰蛊毒。”《中华本草》记载其味苦、微辛，性热，有大毒，主治跌打损伤，神经痛，湿疹，痈肿，风湿痹痛[2]。现代研究表明钩吻具有抗肿瘤、镇痛、增强免疫、促进造血等作用，特别对于无成瘾性镇痛和抗肿瘤等方面具有明显的优势，由于钩吻的毒性较大，且其治疗量和中毒量非常接近，安全指数小，剂量不易控制，容易发生中毒反应，每年均不乏钩吻中毒的临床报道[3]，限制了其临床的广泛应用。但由于其临床疗效显著，如何避害就利，开发出疗效好、毒副作用小的钩吻生物碱新药[4-5]是我们的研究目标。

“药以治病,因毒为能”,因此只要能合理应用有毒中药的药效功能,减少药物的毒副作用，就能趋利避害,发挥其积极而突出的作用[6]。中医药对毒性中药的应用有着悠久的历史，积累了许多降低药物毒性、改变药物性能的宝贵经验。其中对毒性药材进行特殊加工处理，使药物的毒性降低且保留原有功效，达到“减毒增效”目的，是降低有毒中药的最有效方法之一，也是传统中药应用的一大特色。如马钱子经砂烫炮制后，马钱子中的马钱子碱大量被破坏,而士的宁则只有部分被破坏，起到了降低毒性的作用[7]。乌头经加热煮沸或水处理等炮制,能使有毒成分水解，降低毒性[8]。

面对钩吻的极大毒性和显著而独特的临床疗效，如何通过科学的炮制方法在保持或提高其疗效的前提下，降低或消除其毒性，达到避害就利，阐述炮制机理是钩吻研究的一大核心问题与关键所在，也是国内外药学工作者非常重视的研究课题。查阅目前国内外文献，对钩吻的研究主要集中在资源、化学、药理以及毒性方面的研究，通过全面的文献复习，发现对钩吻炮制方面的相关研究还未见报道。本课题组在前期系统性地开展了12种钩吻传统炮制减毒工艺研究的基础上，通过对砂炒钩吻炮制工艺进行创新性改进，以期获得稳定可控、低毒高效的钩吻炮制饮片，对钩吻的进一步研究开发具有重要意义。

1 仪器与实验材料

1.1 仪器

电子分析天平(FA20004N,北京赛多利斯天平有限公司)，旋转蒸发仪(RE-52,上海亚荣生化仪器厂)，中草药粉碎机(FY135,天津市泰斯特仪器有限公司)，超声波清洗器(KQ-500E,昆山市超声仪器有限公司)，烤箱(YK38GS,佛山市优益电器有限公司)，冷冻干燥机(DHG-9023A,上海精宏实验设备有限公司)，数显恒温水浴锅(HH-1,常州国华电器有限公司)，高温测温仪(GM1150/1500,深圳市聚茂源科技有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9023A,上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 试剂

阿司匹林(20130626,石药集团欧意药业有限公司),冰醋酸(20140630)、乙醇(20150929)购于国药集团化学试剂有限公司,其余试剂均为分析纯。

1.3 药材

钩吻药材采于福建省龙岩市，经福建中医药大学药学院车苏容副教授鉴定为马钱科胡蔓藤属植物干燥的藤茎，切制成约2 mm饮片。

1.4 实验动物

清洁级KM小鼠，雌雄各半，6～8周龄，体质量18～22 g，购于福州吴氏实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(沪)2013-0016，试验前，将小鼠置20～25℃SPF级动物实验室(许可证号，SCXK(闽)2014-0005)中饲养1周,标准饲料,无菌饮用水。

2 方法与结果

2.1 药物制备

将钩吻药材粉碎，过筛，取适量置于圆底烧瓶中，加入7倍量95%乙醇，浸泡0.5 h，回流提取3次，每次提取2 h，趁热过滤，合并上清液，减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，4℃保存备用。临用前用0.5%CMC-Na溶液配制成适合浓度。

2.2 急性毒性实验

将实验小鼠随机分成若干组，实验前禁食12 h，自由饮水。按最大的剂量分别灌胃给药，观察1 d内的死亡情况[9]。

2.3 醋酸所致小鼠扭体反应模型

取KM小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g，采用随机分组的方法将实验小鼠分为模型组、阳性对照组、不同炮制品给药组，阳性对照组(阿司匹林0.2 g/kg)组及各给药组按0.2 mL/10 g剂量灌胃给予相应药液，模型组灌胃给予相应体积的生理盐水小连续灌胃给药3天，每天1次。末次给药0.5 h后将0.6%醋酸溶液(0.2 mL/10 g，临用前配制)注射于小鼠腹腔内，以引起深部、大面积而持久的疼痛刺激，致使小鼠产生扭体反应(腹部收缩内凹、仲展后肢、臀部抬高、蠕行)，观察各组小鼠出现扭体反应的时间(潜伏期)及15 min内扭体反应的次数[10-11]。计算镇痛率，公式为镇痛率=(模型组扭体次数-给药组扭体次数)/模型组扭体次数×100%。

2.4 统计学方法

2.5 单因素试验考察

2.5.1 炮制设备的改进

传统的砂炒炮制，都是将砂子用武火加热到一定的温度，砂炒一般温度较高，与自然环境的温度差别大，不容易将温度控制在某一范围内，稳定性差，得到的炮制品不稳定。后来采用马沸炉高温加热的方法，饮片受热较为均匀，可以得到相对稳定的炮制品。但是在炮制过程中，翻动药材不方便，耗费时间较长，故需对设备进一步改进。因此，课题组将市场上的电烤箱进行改进，在电烤箱中间焊接一不锈钢中空圆筒，即可放置炮制品又能达到控温效果好、受热均匀的效果。经过改装后的设备炮制药材，不需使用砂子，因此只需考虑炮制温度和时间。

2.5.2 炮制温度

取已分好档的钩吻药材(直径2～4 cm，厚约2 mm)5份，每份50 g，选取炮制温度分别为190，200，210，220，230℃。

2.5.3 炮制时间

根据预实验，药材颜色产生明显改变以后，才能初步判断炮制品的毒性发生显著的降低，因此炮制时间随不同的炮制温度变化。190℃炮制50，60，70 min；200℃的炮制时间为10，20，30，40 min；210℃炮制时间为10，20，30 min；220℃炮制时间为10，15，20 min；230℃炮制时间为10，15 min。

2.5.4 实验结果

2.5.4.1 外观颜色变化

在炮制过程中发现，随着温度的升高和时间的逐渐延长，炮制品的颜色逐渐加深，由生品的黄白色逐渐变为浅褐色、褐色和深褐色，最后变成炭黑色。

2.5.4.2 各组炮制品毒性反应

小鼠给药后如有中毒，一般给药2～15 min后出现毒性反应，其主要表现为发抖、四肢无力及运动失调，呼吸减慢，很快就转向兴奋状态，叩牙频繁，并伴有痉挛，痉挛强度逐渐增大，继而间歇性的惊厥、跳跃，随即出现全身性剧烈的强直性惊厥，最后呼吸衰竭而死亡。本实验小鼠(除1、4组外)出现症状后，并未转向兴奋，频繁叩牙，无痉挛及惊厥现象，2 h后完全恢复正常，其毒性反应特征与钩吻生品中毒反应基本一致[12-13]。见表1。

2.5.4.3 各组炮制品对小鼠的镇痛作用

从表2可以看出，钩吻经炮制减毒后，仍然保留一定的镇痛效应，而且各组差异较大，不同温度的炮制品均有镇痛作用较好的炮制品，并有随炮制时间的延长，镇痛效应明显下降的趋势，通过对炮制温度和时间因素的考察，对炮制品的外观、毒性和镇痛药效综合考虑，在炮制温度200～220℃，炮制时间在10～20 min内进行最佳工艺优选。

表1 各组炮制品毒性情况

2.6 Box-Behnken响应面试验

在单因素试验基础上，按Design-Expert 8.0.6.1中星点设计(CCD)进行实验设计[14-15]，每份固定加入50 g钩吻切片，选取炮制温度200～220℃、炮制时间在10～20 min为自变量因素，2个自变量分别以-1，0，1水平编码，以钩吻的镇痛药效为响应值，试验安排与结果见表3,4。

表2 钩吻各炮制品对小鼠冰醋酸致痛作用的影响

注：与空白组对照比较,*P<0.05,**P<0.01；与阳性组对照比较,△P<0.05

表3 响应面试验因素水平表

表4 钩吻炮制工艺Central-Composite设计方案及响应值

利用Design-Expert8.0.6.1软件对表2 试验数据进行二次多项式回归拟合，得到的数学模型为Y =+47.53-3.83*A+2.57*B-0.47*A*B-3.61A2-2.10*B2,对该模型进行方差分析，结果P=0.033 5<0.05，说明该模型具有显著性，与实际实验拟合较好；模型方程R2=0.770 6，说明建立数学模型的实测值与预测值间具有高度的相关性；模失拟项(P=0.201 1>0.1)不显著，说明失拟项和纯误差的差异不显著，该二次回归模型能够较显著拟合炮制时间、温度对钩吻炮制品镇痛药效的影响。

方差分析结果还表明，方程一次项中A、B对响应值影响显著，二次方项A2对响应值影响都显著，交互项对响应值影响不显著。由此可见，各试验因素对响应值的影响并不是简单的线性关系。各因素(炮制温度和时间)的影响程度，可以通过F值来判断，F值越大，则因素对响应值的影响越显著。从方差分析表中可知，FA=9.82，FB=4.43，通过数值比较发现，炮制时间比温度的影响更大。

根据拟合的二项式方程，用Design Expert8.0.6.1软件绘制3D效应图，考察各自变量对钩吻高温炮制工艺的影响。得钩吻药材的最佳炮制工艺为：即炮制温度210 ℃，炮制15 min。见图1，2,3,4。

表5 回归模型方差分析表

图1 残差的正态概率分布

图2 残差与方程预测值的对应关系图

图3 预测值与实验实际值的对应关系图

图4 3D图

2.7 验证性试验

2.7.1 药效验证

取钩吻药材50 g，按优选的炮制工艺条件进行炮制，药材经炮制后炮制品表面呈褐色，镇痛率为46.318%，说明优选的炮制工艺可较好地预测钩吻的工艺。

2.7.2 急性毒性实验

预试验:取KM种小鼠20只，预试性灌胃给药，按小鼠一次性能承受的最大容积灌胃(25 mL/kg)[16]，当日灌胃2次，在饲养条件下观察14天，给药14天后，处死所有小鼠，肉眼观察其内脏组织均未见异常，实验结果提示钩吻经2.6工艺炮制后可能毒性很低。

3 讨论

本研究在对毒性中药钩吻进行酒制等12种传统炮制法炮制后的毒效综合评价的基础上，确定了砂炒钩吻的减毒存效最为理想，为了进一步改进砂炒工艺，我们采用了烘烤箱高温加热法，以镇痛药效、急性毒性为评价指标，在单因素试验基础上，选择炮制时间、炮制温度为自变量，采用星点设计(Central Composite Design)-响应面法优选钩吻炮制工艺的研究。研究发现，在钩吻190～230 ℃温度下，经过10～60 min的炮制后，经炮制以后减毒明显降低，仍然保留一定的镇痛效应，对炮制品的外观、毒性和镇痛药效综合考虑，在炮制温度200～220 ℃，炮制时间在10～20 min内进行最佳工艺优选，得到钩吻的最佳炮制工艺，炮制温度210 ℃，炮制时间15 min，在此条件下进行验证性实验性，结果与实验预测值较为接近，说明采用响应面法得到的工艺参数可靠，具有一定的实用价值。钩吻炮制后毒性明显降低，同时又保留了原来良好的镇痛药效，取得了良好的预期结果。对其炮制前后化学成分变化规律的研究结果将在另文探讨。

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ExperimentalStudyontheToxicityAttenuationandEfficacyReservationofPuerariaIobataBasedonSpectrum-effectRelation

WUShui-sheng1,LIDe-sen1,XUHao-ran2,LIAOHua-jun1,CHENLiang3,LIDan3

(1.FujianUniversityofTCM,Fuzhou350122,China; 2.NorthMalaysiaTCMCollege,Penang13200,Malaysia; 3.FuzhouTCMHospitalAffiliatedtoFujianUniversityofTCM,Fuzhou350001,China)

Objective: To study the toxicity attenuation and efficacy reservation ofPuerariaIobataprocessed by hot sand frying. Methods: Analgesic effect and acute toxicity were taken as evaluation index to select the preferable process by using oven heating method, with processing time and processing temperature as the independent variable in central composite design-response surface test. Results: The toxicity was significantly reduced, and certain analgesic effect was retained inPuerariaIobataunder 190～230 ℃ after 10～60 min of preparation. After comprehensive consideration, the optimized process was narrowed down to temperature of 200～220 ℃ and time 10～20 min after. The best process was finally confirmed at temperature of 210℃, processing time was 15min. Under this condition, the experimental results were in good agreement with the experimental predictions, which showed that the process parameters obtained by response surface method were reliable and had practical value. Conclusion: Hot sand frying can attenuate the toxicity and preserve analgesic effect ofPuerariaIobata.

PuerariaIobata; Processing; Toxicity attenuation and efficacy reservation; Central composite design - response surface methodology

R283.1

A

1002-2392(2017)05-0080-05

2017-04-24

2017-09-20

福州市科技局资助项目(2014-S-140-3)

吴水生(1965-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事中药药效物质基础研究。

*通讯作者：廖华军(1977-)，男，博士，副教授，主要从事中药活性成分、中药药性理论及炮制研究。