补泻不同配伍补阴方对衰老大鼠免疫相关因子含量影响的比较研究

孙琳林， 梁绍栋，王莉莉，卢林，刘伦翠

(牡丹江医学院附属红旗医院中西医结合科，黑龙江 牡丹江 157011)

方剂研究

补泻不同配伍补阴方对衰老大鼠免疫相关因子含量影响的比较研究

孙琳林， 梁绍栋，王莉莉，卢林，刘伦翠*

(牡丹江医学院附属红旗医院中西医结合科，黑龙江 牡丹江 157011)

目的：分析和比较具有补泻不同配伍特点的两经典补阴方左归丸和六味地黄丸及两方共有“三补”药物组对D-半乳糖致亚急性衰老大鼠免疫相关因子的影响。方法：观察左归丸、六味地黄丸及两方共有“三补”药物组对D-半乳糖(D-gal)致亚急性衰老模型大鼠血清白介素-1 (IL-1)、白介素-2 (IL-2)、白介素-8 (IL-8)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)含量及肾脏表面生长因子(EGF)表达的影响。结果： 亚急性衰老大鼠血清IL-1、IL-8、TNF-α含量升高，IL-2含量降低，肾脏EGF表达水平下调；与模型组相比，三给药组对IL-1、TNF-α含量具有降低作用，对IL-2有明显的升高作用，对EGF表达水平具有上调作用，对IL-8含量六味组具有显著的降低作用，三补组和左归组均无显著降低作用。结论：左归丸、六味地黄丸及三补药物组对D-半乳糖引起的衰老大鼠血清中的IL-1、TNF-α均有不同程度的抑制作用，对IL-2和EGF在肾脏的表达有明显的升高作用。三组观察药物可能是通过抑制白介素和TNF-α等致炎因子和促进IL-2和EGF的保护作用来调整亚急性衰老模型大鼠的免疫机能，抑制炎症损伤，从而达到延缓衰老的效果。两方存在补泻配伍方式的不同，相对来说六味地黄丸的作用更为明显和稳定，说明恰当的配伍对中药复方疗效的强度和稳定性具有重要作用。

左归丸；六味地黄丸；三补；免疫；配伍

当今，世界人口老龄化趋势加快，由此引起老年病发病比率逐年升高，人们对抗衰老药物，尤其是中医药抗衰方剂日益重视。左归丸和六味地黄丸是公认的抗衰经典方剂，均具有滋补肾阴的作用，在配伍上两方均以“三补”为基础，前者纯甘壮水，阳中求阴，后者补中寓泻，补泻兼顾，目前两方的抗衰药理作用的实验研究较多，但两方在抗衰作用方面的比较研究还少有报导。本实验观察了左归丸和六味地黄丸及两方共有组分“三补”对D-半乳糖(D-gal)致亚急性衰老大鼠免疫相关因子的影响，并对两方的作用进行了分析和比较，现将结果报导如下。

1 材料与方法

1.1 用药及制备

六味地黄丸(熟地黄24 g，山药12 g，山萸肉12 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g，泽泻9 g)，左归丸(熟地黄24 g，山药12 g，山萸肉12 g，菟丝子12 g，龟板胶12 g，枸杞12 g，牛膝9 g和鹿角胶12 g)及“三补”药物组(熟地黄24 g，山药12 g和山萸肉12 g)，中药饮片购自牡丹江医学院附属红旗医院草药局，水煎后4 ℃冷藏保存，左归丸煎制后浓度为0.63 g/mL，六味地黄丸煎制后浓度为0.45 g/mL，“三补”药物组煎制后浓度为0.29 g/mL。

1.2 动物及分组

取Wistar大鼠60只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，雌雄各半，体质量(300±20)g，体质量区域化后随机分为正常组、模型组、六味组、三补组和左归组，每组12只。

1.3 造模及给药

根据《药理实验方法学》，选择以D-半乳糖致大鼠亚急性衰老为模型[1]。具体造模方法如下：将D-gal 5 000 mg溶于生理盐水500 mL中，配成10 mg/mL浓度的溶液，按300 mg/(kg·d)剂量给大鼠腹腔注射，正常对照组大鼠注射等体积生理盐水，造模周期为8周。各给药组(即左归组、六味组和三补组)于造模开始的同时按10 mL/kg每日上午分别给予上述煎煮好的相应治疗药物，正常组和模型组给生理盐水，灌胃给药，每日1次。各给药组的给药剂量分别为左归组9.45 g/kg、六味组6.75 g/kg、三补组4.32 g/kg，给药周期为8周。8周后各组大鼠断头取血，分离血清，按要求保存待测。

1.4 指标及检测

观察指标包括白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)及肾脏表面生长因子(EGF)，所需酶联免疫测定试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司，指标检测均按照试剂盒提供的方法及要求进行操作，免疫组化采用Motic Med 6.0彩色病理图像分析系统进行分析和计数。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 对衰老大鼠血清白介素的影响

从表1可以看出：模型组大鼠血清中白介素-1和白介素-8活性均明显高于正常组，差异具有显著性(P<0.01或P<0.05)；对白介素-1的影响，三给药组与模型组具有显著性差异(P<0.01或P<0.05);对白介素-8的影响，六味组有显著的降低作用(P<0.05)，另两个给药组与模型组相比无显著性差异(P>0.05)；对白介素-2的影响，模型组含量较正常组明显降低，差异具有显著性(P<0.01)，各给药组与模型组相比具有升高的作用，其差异显著有统计学意义(P<0.01)。

表1 对衰老大鼠血清IL-1、IL-2、IL-8活性的影响

注：与模型组比较,*P<0.05，**P<0.01

2.2 对衰老大鼠血清肿瘤坏死因子-α含量的影响

从表2可以看出：模型组大鼠血清中的TNF-α活力明显高于正常组，具有显著性差异(P<0.01)；各给药组血清TNF-α的含量明显降低，与模型组相比具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，其中六味组和三补组降低效果较左归组差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。

表2 对衰老大鼠血清肿瘤坏死因子-α含量的影响

注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01

2.3 对衰老大鼠肾脏表面生长因子表达的影响

从表3可以看出：模型组大鼠肾脏EGF表达明显低于正常组，具有显著性差异(P<0.01)；各治疗组大鼠肾脏EGF表达均有升高，与模型组相比具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，其中六味组升高效果较好，与另两组给药组相比差异显著,具有统计学意义(P<0.05) (见图1)。

表3 对衰老大鼠EGF表达的影响

注：与模型组比较,*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

中医认为肾精亏虚是衰老发生的内在的根本性机制之一，古人常用具有补肾填精作用的中药延年益寿。本文所选观察药物是公认的可以通过其补肾填精作用达到延缓衰老目的的经典补阴方，左归丸与六味地黄丸均是补肾填精的传统名方，两方共有的“三补”药物组是中医临床补肾填精汤方中的常用药物配伍[2]。现代实验研究亦证明[3-5]补肾填精中药复方既可以影响细胞周期，减缓细胞衰老，又可以抑制炎症因子；并且，通过对肾藏精与衰老在自由基、免疫功能等方面的研究发现，在衰老发生这一过程中，肾藏精应该为物质基础，肾虚渐亏是衰老的病机核心。

随着世界人口老龄化的加快，现代医学对衰老的发生机制亦有了较为深刻的了解。经研究发现，人体衰老过程中免疫衰老是主要原因之一，衰老引起的最明显的现象是免疫系统失调，包括免疫衰退和慢性炎症[6]；免疫系统功能衰退可以削减机体的免疫保护作用，同时产生慢性炎症状态，从而增加了患自身免疫性疾病的风险[7]。因此，有人称衰老是一种流行性免疫病[8]。在这一过程中，衰老的自然杀伤细胞(NK)杀伤毒力降低，成熟障碍，衰老的NK细胞一方面分泌保护因子的含量不足，另一方面又会分泌较多的致炎因子，如白介素-1 (IL-1)，白介素-8 (IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等[9]。

图1 大鼠肾脏表面生长因子表达的影响(400×)

亚急性衰老模型的造模机制在于当体内蓄积过量的D-半乳糖后，D-半乳糖可被醛糖还原酶还原成半乳糖醇，这一过程可引起活性氧类(reactive oxygen species, ROS)的积聚，造成机体的氧化应激损伤；同时被激活的ROS又会诱导TNF-α和白介素家族多种细胞因子的表达[10]， TNF-α和白介素家族多种细胞因子等促炎细胞因子可加剧炎症反应，诱导细胞衰老和细胞凋亡[11-13]；在这一损伤过程中表皮生长因子(EGF)可通过与细胞膜上的EGF受体结合而广泛作用于机体各组织和器官，对细胞的生长和增值产生明显的促进作用，有利于炎症损伤的修复。研究报道，在正常的脑老化过程中和在年龄相关的神经系统退行性病变中，氧化应激与炎性反应的增加表现尤为突出[14-15]，因此，D-半乳糖致衰老作用可以较好地体现氧化应激及免疫炎性反应两个方面的衰老机制。

本研究结果发现，左归丸、六味地黄丸及三补药物组对D-半乳糖引起的衰老大鼠血清中的IL-1和TNF-α均有不同程度的抑制作用，对EGF在肾脏的表达有明显的上调作用，对于炎症保护因子IL-2，三给药组均有显著升高作用，对IL-8六味组有显著的降低作用。三组观察药物可能是通过抑制致炎因子和促进保护作用来调整亚急性衰老模型大鼠的免疫机能，抑制炎症损伤，从而达到延缓衰老的效果。中药的应用需讲究严谨的配伍，左归丸和六味地黄丸均是配伍严谨的补肾名方[16-17]，两方一则纯补无泻，一则补泻兼顾，配伍思想尽管相反，但对现代临床中药的应用均有很高的指导价值。从本研究的结果分析，似乎补泻兼顾的六味地黄丸在对免疫炎症损伤的抑制作用方面效果更为稳定和明显，笔者分析，这一方面说明恰当的配伍对中药复方疗效的强度和稳定性具有重要作用，另一方面原因可能与补益药“滋腻碍胃”的弊端有一定的关系，因为补泻兼顾的配伍可以对补益药的滋腻之性有一定的抑制作用，纯补无泻的配伍很可能因为对消化吸收功能产生影响而引起对免疫功能的提高和炎症损伤的抑制作用减弱。但在这一点上到底是由于“滋腻之性”引起药物的吸收不完全的原因导致的效果不如六味地黄丸明显，还是“滋腻之性”造成了消化吸收功能的负担而加重了氧化应激和炎性损伤的原因引起的，很值得我们进一步探索和研究。

[1] 徐叔云,卞如濂.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社, 2006:1464-1466.

[2] 孙琳林,王书惠,卢林,等.左归丸与六味地黄丸对衰老大鼠抗氧化能力及海马区超微结构影响的比较研究[J].中医药学报, 2012,40(3):140-143.

[3] 张秋华,孙文静. 补肾益气活血方对衰老小鼠免疫功能的影响[J].中医药学报,2011,39(1):20-22.

[4] 王国力,邓虎,徐艳玲.补肾中药复方对COPD模型大鼠肺内炎性因子的影响[J].世界中西医结合杂志,2017,12(2):196-199.

[5] 杨帆,孙晓霞,孟静岩.肾藏精与衰老关系的研究进展[J].中华中医药杂志, 2013,28(3):758-760.

[6] Montecino-Rodriguez E,Berent-Maoz B, Dorshkind K.Causes,consequences,and reversal of immune system aging[J].J Clin Invest,2013,123:958-965.

[7] Goronzy JJ, Li G,Yang Z, et al. The janus head of T cell aging-autoimmunity and immunodeficiency[J].Front Immunol,2013(4):131.

[8] 丛秀丽,赵启明.免疫系统与机体衰老[J].中国美容医学,2017,27(1):16-20.

[9] Rink L,Cakman I and Kirchner H. Altered cytokine production in the elderly[J]. Mech Ageing Dev,1998,102:199-209.

[10] Woo JY,Gu W,Kim KA,et al.Lactobacillus pentosusvar plantarum C29 ameliorates memory impairment andinflammaging in a d-galactose-induced accelerated agingmouse model[J].Anaerobe,2014(27):22-26.

[11] Zhao X, Bian Y, Sun Y, et al. Effects of moderate age- related physiological dysfunction exercise different phases mice[J].In Testes of Experimental Gerontology,2013,48(9):869- 880.

[12] 刘静,张长城,韩贵芳,等.三七总皂昔对自然衰老大鼠翠丸炎症反应和生殖细胞凋亡的影响[J].中药新药与临床药理,2016,27(5):644-649.

[13] 葛志华,李俊玫,冯振林,等.何首乌饮对D-半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺EGF、EGFmRNA表达的影响[J].中国老年学杂志,2011,31(2):250-252.

[14] Gandhi S,Abramov AY.Mechanism of oxidative stress inneurodegeneration[J].Oxid Med Cell Longev,2012,(3):1-9.

[15] 马莹娟,尚玉莹,王德杰,等.柿叶黄酮类化合物对D-半乳糖致衰老小鼠的抗炎抗氧化神经保护作用[J].复旦学报(医学版),2015,42(1):7-13.

[16] 郝迪,刘宏,黄树明.左归丸对卵巢切除MCAO模型大鼠学习记忆功能的影响[J].中医药学报,2014,42(1):122-124.

[17] 高长玉,李冀,李博文,等.六味地黄丸改善脑瘫模型大鼠运动功能的实验研究[J].中医药学报,2017,45(2):80-82.

ComparativeStudyofRelevantImmuneFactorsinAgingRatsIntervenedbyNourishing-yinFormulawithDifferentCompatibility

SUNLin-lin,LIANGShao-dong,WANGLi-li,LULin,LIULun-cui

(HongqiHospitalAffiliatedtoMudanjiangMedicalCollege,Mudanjiang157011,China)

Objective: To analyze and compare the effect of the two classical formula with action of nourishing yin, Zuogui Pill and Liuwei Dihuang Pill, which have different compatibility characteristics, and to investigate relevant immune factors influenced by “Sanbu”(three medicinal with supplementing function),which is common to both formula, in sub-acute aging rats induced by D-galactose. Methods: The content of IL-1, IL-2, IL-8, TNF-α, and the expression of EGF in sub-acute aging rats were observed after the intervention with Zuogui Pill, Liuwei Dihuang Pill and “Sanbu”. Results: After modeling, the content of IL-1, IL-8 and TNF-α were increased, but the content of IL-2 and the expression of EGF were decreased. Compared to the model group, the levels of IL-1 and TNF-α were degraded, and IL-2 level and EGF expression were raised obviously by the medications; IL-8 content was decreased obviously by Liuwei Dihuang Pill, however, there were no significant reducing effect in the other two groups. Conclusion: There are different inhibition effect on IL-1 and TNF-α, and up-regulation effect on IL-2 and EGF in sub-acute aging rats, when they are treated by Zuogui Pill, Liuwei Dihuang Pill, or “Sanbu”, which may be related to the inhibition of the inflammatory factors and the adjustment of immune protective effect. There are different compatibility pattern in terms of reinforcing and reducing in the two formulas; comparatively, the effect of Liuwei Dihuang Pill is more obvious and stable, which shows appropriate compatibility playing an important role on the strength and stability of Chinese medicine formula.

Zuogui Pill; Liuwei Dihuang Pill; “Sanbu”; Immune; Compatibility

R289.1

A

1002-2392(2017)05-0076-04

2017-01-17

2017-09-15

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12531738)

孙琳林(1979-)，女，博士，副主任医师，副教授，主要从事中西医结合教学、临床及科研工作。

*通讯作者：刘伦翠(1955-)，女，主任医师，教授，主要从事老年医学的教学、临床及科研工作。