蛭龙活血通瘀胶囊对脑出血大鼠脑组织AQP-4、MMP-9表达的影响

王蔚，杜渊，白雪，杨思进

(西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000)

蛭龙活血通瘀胶囊对脑出血大鼠脑组织AQP-4、MMP-9表达的影响

王蔚，杜渊，白雪，杨思进*

(西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000)

目的：通过观察蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑出血后AQP-4、MMP-9蛋白及基因表达的影响，探讨蛭龙活血通瘀胶囊对脑组织的保护作用机制。方法: 将45只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、蛭龙活血通瘀胶囊高、中、低剂量组，各组又分为12 h、48 h、72 h三个亚组，采用自体尾部血注入法制备脑出血大鼠模型，Western blot法检测AQP-4、MMP-9蛋白，RT-PCR法检测AQP-4、MMP-9 mRNA的表达。结果: 与模型组比较，ZL各剂量组AQP-4、MMP-9蛋白及基因表达均有不同程度的降低，具有显著性差异(P<0.01)；ZL各剂量组之间比较，以高剂量组为对照，低、中剂量组在各时间点脑组织AQP-4、MMP-9表达具有显著性差异(P<0.01)。结论: 蛭龙活血通瘀胶囊能够明显降低脑出血大鼠脑组织AQP-4、MMP-9蛋白及基因的表达，该作用存在一定的量效关系，ZL高剂量组作用最为明显。

蛭龙活血通瘀胶囊；脑出血；AQP-4；MMP-9

脑出血是常见的内科急症，临床病理研究证实[1]，脑出血急性期恶化和死亡的主要原因是脑水肿及出血。脑出血后在出血区域形成血肿，对周围脑组织造成压迫，引起脑内的急性占位效应，并对周围的脑组织产生进一步的损害，因此脑水肿被认为是脑出血后最重要的继发性病理变化之一。研究表明[2-3]，水通道蛋白-4(aquaporins-4，AQP-4)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)与脑水肿密切相关，参与了多种疾病所引起的脑水肿的病理过程。本实验研究观察具有益气活血、化瘀通络功效的蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑出血后脑组织AQP-4、MMP-9蛋白及基因表达的影响。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级的雄性健康SD大鼠45只，体质量250 g～300 g，由西南医科大学动物实验中心提供，实验动物使用许可证号:SYXK(川)2013-065。动物按照每笼5只进行饲养，室温(22±2)℃，湿度30%～40%，常规饲料喂养，自由摄食及饮水。

1.2 药物及试剂

蛭龙活血通瘀胶囊：主要成分包括黄芪、水蛭、地龙、大血藤、桂枝等药物，规格为0.4 g/粒，相当于生药 2.625 g，由西南医科大学附属中医医院制剂室提供，批号为20151201；兔抗AQP-4多克隆抗体：Santa Cruze，Sc-20812；兔抗MMP9多克隆抗体：proteintech,10375-2-AP；蛋白marker：Thermo fermentas,SM0431；β-action抗体：中杉金桥，TA-09；DNA marker：大连宝生物，DL2000；G250考马斯亮蓝溶液：上海生工，A602151-0250；逆转录试剂盒：Thermo scientific，#K1622；Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(曝光液)：Minipore，WBKLS0100。

1.3 实验仪器

大鼠脑立体定位仪：安徽正华生物仪器设备有限公司；Thermo 991-80℃超低温冰箱：美国赛默飞世尔；IMS-40全自动雪花制冰机：常熟雪珂电器有限责任公司；KJ201-BS型震荡器：江苏康健医疗用品有限公司；DYY-10C电泳仪：北京六一仪器厂；Mini-Protean小垂直板电泳槽：美国Bio-Rad；Y-SPCT型水平电泳槽：北京君艺东方；Trans-Blot转印槽：美国Bio-Rad；ChemiDoc XRS凝胶成像系统：美国Bio-Rad；LS-P96G PCR仪：美国Thermo Fisher LabServ；BioMate 3S紫外分光光度计：美国Thermo Fisher LabServ。

2 方法

2.1 动物造模及模型评估

大鼠术前禁食12 h，麻醉后断尾取尾部自体血50 μL。将大鼠用立体定位仪俯卧位固定，备皮消毒，暴露手术区域，沿头皮正中纵行切开约10 mm，用30%双氧水腐蚀骨膜，参照的Rosenber[4]的方法，并根据《脑立体定位图谱》[5]进行尾壳核定位(矢状缝右侧旁开3.0 mm，前囟前0.2 mm处)，用微量进样器按5 μL/min的速度缓慢匀速注入自体血后，留针15 min缓慢退针，骨蜡封闭颅骨，缝合头皮。假手术组只进针，不注血。

参照Zea Longa[6]“5分制法”对大鼠进行神经功能缺损评分。以评分为1～3分认为造模成功，0分则认为造模失败，4分和死亡大鼠均被剔除实验并根据分组进行相应补充。假手术组大鼠在术后清醒后无明显神经功能缺损症状，评分为0分。

2.2 动物分组及给药

将45只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、蛭龙活血通瘀低、中、高剂量组(分别简称为“ZL低剂量组”“ZL中剂量组”“ZL高剂量组”)，每组9只。并按指标检测的时间划分为12 h、48 h、72 h 3个亚组，每亚组3只。

大鼠麻醉自然苏醒后进行灌胃。各药物组均给予蛭龙活血通瘀胶囊药物的等体积和相应的浓度进行灌胃。蛭龙活血通瘀胶囊成人的临床用药量为3.6 g/d，按照人体用量的5倍、10倍、20倍定为低、中、高剂量。成人体重按60 kg计算，换算成各药物组大鼠的每日用药量，分别为0.3 g/kg/d、0.6 g/kg/d、1.2 g/kg/d。大鼠的灌胃体积为3 mL/次，给药次数为1次/日。模型组、假手术组给予同药物组等体积(3 mL/次)的生理盐水灌胃，给药次数同药物组。

2.3 检测指标

2.3.1 脑组织AQP-4、MMP-9蛋白的表达

采用蛋白质印迹法(Western blot)。称取0.05 g脑组织提取蛋白，考马斯亮蓝比色法测定蛋白浓度并经凝胶染色检测提取蛋白质量。按照Western blot操作步骤，制胶→电泳→转膜→封闭→一抗孵育→二抗孵育，孵育完毕用TBST洗PVDF膜3次，每次5 min，将PVDF膜倒扣在曝光液中，约1 min后通过凝胶成像系统进行信号检测。各目的蛋白的相对表达量为测定的目的蛋白灰度值与内参β-actin灰度值之间的比值。

2.3.2 脑组织AQP-4、MMP-9 mRNA的表达

采用逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)法。在NCBI Gene Bank中查询大鼠AQP-4及β-actin的cDNA序列，引物特异性经NCBI Primer Blast软件分析，由上海生物工程有限公司合成。AQP-4(size 403 bp)：上游5′-CTGTAGCCTAAGTCACTGGT-3′，下游5′-TGTCAGAGAGGTCATGTCTC-3′；MMP-9(size 495 bp)：上游5′-TGCGTATTTCCATTCATC-3′，下游5′-CCTTGGGTCAGGTTTAGAG-3′；β-Actin(size 654bp)：上游5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′,下游5′-AGGTCTTTACGGATGTCAACG-3′。按照RT-PCR操作步骤，提取RNA→合成cDNA→RT-PCR扩增→RNA电泳，电泳结束后采用凝胶成像系统进行图像分析。各目的基因的相对表达量=目的基因条带灰度值/β-actin基因条带灰度值。

2.4 统计方法

3 结果

3.1 蛭龙活血通瘀胶囊对AQP-4蛋白的影响

表1结果显示，假手术组大鼠脑组织中有微量水平的AQP-4蛋白表达，在12 h、48 h及72 h的表达量无明显差异(P>0.05)；与假手术组相比，模型组及ZL低、中、高剂量组各时间点AQP-4蛋白的表达均明显高于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.01)；模型组术后AQP-4蛋白表达呈进行性升高，72 h时最为显著，与模型组相比，ZL各剂量组表达均有不同程度的降低，具有显著性差异(P<0.01)；ZL各剂量组之间比较，以高剂量组为对照，低、中剂量组在各时间点脑组织AQP-4蛋白的表达具有显著性差异(P<0.01)。

3.2 蛭龙活血通瘀胶囊对MMP-9蛋白的影响

表2结果显示，假手术组大鼠脑组织中MMP-9蛋白有少量的表达，术后12 h、48 h及72 h时表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；与假手术组比较，模型组及ZL低、中、高剂量组各时间点表达均明显高于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.01)；模型组术后脑组织MMP-9蛋白表达48h时达到高峰，72 h时略有下降，与模型组相比，ZL各剂量组MMP-9蛋白表达均降低，具有显著性差异(P<0.01)；ZL各剂量组之间比较，以高剂量组为对照，低、中剂量组各时间点脑组织MMP-9蛋白表达具有显著性差异(P<0.01)。

表1 各组大鼠脑组织AQP-4蛋白相对表达量比较

注：与模型组比较，★P<0.01；与假手术组比较，▲P<0.01；与高剂量组比较，◆P<0.01

表2 各组大鼠脑组织MMP-9蛋白相对表达量比较

注：与模型组比较，★P<0.01；与假手术组比较，▲P<0.01；与高剂量组比较，◆P<0.01

3.3 蛭龙活血通瘀胶囊对AQP-4 mRNA的影响

表3结果显示，假手术组大鼠脑组织中有微量AQP-4 mRNA表达，且在12 h、48 h及72 h时表达量无明显差异(P>0.05)；与假手术组相比，模型组及ZL低、中、高剂量组大鼠在以上各时间点AQP-4 mRNA的表达均明显高于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.01)；模型组大鼠在术后脑组织AQP-4 mRNA表达呈进行性升高，在72 h时最为显著；与模型组相比，ZL各剂量组表达均有不同程度的降低，具有显著性差异(P<0.01)。ZL各剂量组之间比较，以高剂量组为对照，低、中剂量组在各时间点脑组织AQP-4 mRNA的表达较之均具有显著性差异(P<0.01)。

表3 各组大鼠脑组织AQP-4 mRNA相对表达量比较

注：与模型组比较，★P<0.01；与假手术组比较，▲P<0.01；与高剂量组比较，◆P<0.01

3.4 蛭龙活血通瘀胶囊对MMP-9 mRNA的影响

表4结果显示，假手术组大鼠脑组织中MMP-9 mRNA有少量的表达，且术后12 h、48 h及72 h时表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；与假手术组比较，模型组及ZL低、中、高剂量组大鼠各时点MMP-9 mRNA表达均明显高于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.01)；模型组大鼠术后脑组织MMP-9 mRNA表达48h时上升明显并达到高峰，72 h时略有下降，与模型组相比，ZL各剂量组MMP-9 mRNA表达均有降低，具有显著性差异(P<0.01)；ZL各剂量组之间比较，以高剂量组为对照，低、中剂量组在各时点脑组织MMP-9 mRNA表达均具有显著性差异(P<0.01)。

表4 各组大鼠脑组织MMP-9 mRNA相对表达量比较

注：与模型组比较，★P<0.01；与假手术组比较，▲P<0.01；与高剂量组比较，◆P<0.01

3 讨论

AQP-4是水通道蛋白家族中的一员，又称为汞不敏感水通道蛋白(mercury insensitive water channel，MIWC)[7]。AQP-4在中枢神经系统分布上最显著的特点呈极性分布，具有高度选择性[8]。AQP-4的两个主要表达区域为，位于形成胶质界膜的致密星形胶质细胞足突上，其参与形成与脑脊液接触的软脑膜和室管膜的表面屏障。位于包绕血管周围的星形胶质细胞的足突上，并在与血管直接接触的足突上呈极性分布[9]。AQP-4的这种分布特点提示AQP-4在维持大脑水的平衡中发挥了重要作用，AQP-4是胶质细胞与脑脊液以及血管间的水调节和转运的重要结构基础[10]。研究表明[11]，脑出血后血肿周围AQP-4表达的升高导致脑水肿的加剧、血脑屏障的通透性破坏、神经功能缺损，提示AQP-4的动态变化与脑水肿、脑损伤发生发展过程密切相关。

MMP-9又被称为明胶酶B(gelatinase-B)，是一种依赖金属锌离子的金属酶，MMP-9参与组织发育与重构，胚胎形成，创伤修复，血管新生等多种生理病理过程[12]。近年的研究表明，MMP-9与脑血管疾病关系密切，在脑出血后脑水肿的形成和发展中发挥重要作用[13-14]。研究显示[15]，MMP-9定位于神经元、血管内皮细胞和胶质细胞，在脑出血时MMP-9含量增加。内源性MMP-9来自星形胶质细胞和小胶质细胞，外源性MMP-9来自内皮细胞、渗出的中性粒细胞和巨噬细胞。MMP-9启动后，可以通过降解细胞外基质成分，从而对血脑屏障完整性造成破坏。在对脑组织、血浆、脑脊液和血肿抽吸液等MMPs蛋白水平的检测结果发现[16-17]，MMP-9于出血后数小时开始升高，达到峰值后很快降低，与脑损害后脑水肿出现的高峰及发送规律疾病一致。

本研究结果显示，脑出血模型大鼠在术后12 h、48 h及72 h脑组织中AQP-4、MMP-9蛋白及基因的表达均有明显上升，其中，AQP-4蛋白及基因表达呈进行性升高，在72h时升高最为明显，MMP-9蛋白及基因表达也有明显升高，在48h时上升明显并达到高峰，在72 h时略有下降。而蛭龙活血通瘀胶囊低、中、高剂量干预组在术后12 h、48 h及72 h时大鼠脑组织AQP-4、MMP-9蛋白及基因的相对表达量均有不同程度的下降，与模型组比较，差异均具有显著性(P<0.01)。由此可得出蛭龙活血通瘀胶囊能够明显降低脑出血大鼠脑组织AQP-4蛋白及基因的表达，且该作用存在一定的量效关系，ZL高剂量组作用最为明显。蛭龙活血通瘀胶囊能够下调AQP-4在脑内的表达，因而具有脑保护作用。

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R285.5

A

1002-2392(2017)05-0072-04

2016-10-12

2017-01-16

四川省科技厅项目：治疗缺血性脑血管疾病的院内制剂——蛭龙活血通瘀胶囊新药临床前研究(2011SZ0322)

王蔚(1983-),女，硕士,主治医师，研究方向：中西医结合防治心脑血管疾病。

*通讯作者：杨思进(1962-),男，主任医师，教授，博导，研究方向：心脑血管疾病的中西医结合治疗。