重组表达萤火虫荧光素酶结核分枝杆菌的构建及其用于最低抑菌浓度测定的研究

李媛媛 陈曦 王彬 付雷 朱慧 陆宇

·论著·

重组表达萤火虫荧光素酶结核分枝杆菌的构建及其用于最低抑菌浓度测定的研究

李媛媛 陈曦 王彬 付雷 朱慧 陆宇

目的构建萤火虫荧光素酶(FFLuc)重组表达的结核分枝杆菌菌株，利用其建立抗结核药物最低抑菌浓度(MIC)检测方法，并应用该方法测定目前主要的抗结核药物的MIC。方法(1) 以质粒pMV306hsp+FFLuc为模板，PCR扩增FFLuc基因。构建重组表达质粒pMV361+FFLuc，电转化至结核分枝杆菌标准株H37Rv中，应用小动物活体成像系统鉴定FFLuc表达。比较结核分枝杆菌与重组结核分枝杆菌生长状态并绘制生长曲线。(2)检测不同浓度的异烟肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、莫西沙星(Mfx)、链霉素(Sm)、左氧氟沙星(Lfx)、利奈唑胺(Lzd)作用不同时间的表达荧光量变化，考察在不同药物作用下FFLuc表达的稳定性，建立以FFLuc标记结核分枝杆菌为基础的测定抗结核药物MIC的方法并测定INH、RFP、EMB、Mfx、Sm、Lfx、Lzd等7种药物的MIC。结果(1)pMV361+FFLuc重组表达载体构建的稳定表达FFLuc的结核分枝杆菌菌株的菌量与荧光表达量(相对荧光强度)呈线性关系[r2=0.994，lg(y)=0.905×lg(x)+0.832]。(2)应用新方法检测的7种药物的MIC与微孔培养显色(MABA)法MIC测定结果基本相同。第4天时荧光检测INH、RFP、Mfx、EMB、Sm、Lfx和Lzd的MIC值分别是0.05、0.05、0.09375、4、0.8、0.15、0.15 μg/ml；与MABA法检测结果相比，结果在相差1～2倍MIC值的可接受范围内。结论建立了FFLuc重组表达的结核分枝杆菌菌株检测抗结核药物MIC的方法与MABA法相比，所需时间更短，第4天即可检测结果。

分枝杆菌，结核； 微生物敏感性试验； DNA，重组； 荧光素酶类, 萤火虫

随着耐药结核病患者的增加，现有抗结核药物不能满足临床治疗的需求，新型抗结核药物的研发迫在眉睫。药效学筛选与评价是抗结核新药研发的重要步骤，最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)的测定是体外药效学筛选与评价的第一步，也是关键的一步。目前，国内外较常用的快速MIC检测方法有微孔培养显色(MABA)法，刃天青微孔板稀释(REMA)法和四唑染料法[1-4]。因其大致需要7～9 d时间，并需要额外加入试剂如噻唑蓝(MTT)或阿尔玛蓝(Alamar blue)，仍不能满足高通量快速筛选抗结核化合物与化合物组合的要求。

荧光或生物发光标记物标记结核分枝杆菌进行MIC测定是一种新的技术。运用生物发光技术可以快速高效地检测细胞的新陈代谢功能，并可在药物筛选试验中作为一种细胞活力的间接标记物。萤火虫荧光素酶是最有效的生物标记分子之一，它可利用三磷酸腺苷(ATP)催化荧光素底物反应而产生光子[5]，所以其特异度强，并只有在活细胞中检测荧光。本研究尝试构建可表达荧光素酶的重组结核分枝杆菌，并通过发光分析建立一种快捷的结核分枝杆菌药物敏感性试验(简称“药敏试验”)方法，以缩短现有MIC测定方法的检测时间，简化测定方法，并节约检测成本。

材料和方法

1.质粒和菌株：pMV361质粒购自普如汀生物技术有限公司，pMV306hsp+萤火虫荧光素酶(FFLuc)质粒购自英国Addgene公司；Ecoli Competent Cells DH5α购自日本TaKaRa公司。结核分枝杆菌标准株H37Rv(ATCC27294)由本室保存。

2.工具酶和主要试剂：T4 DNA连接酶，T-Vector pMDl9(Simple)，限制性内切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ，质粒小提试剂盒(离心柱型)及DNA Marker均为日本TaKaRa公司产品；琼脂糖凝胶回收试剂盒(离心柱型)购自天根生化科技(北京)有限公司；D-荧光素钾盐 (D-luciferin potassium salt)购自美国Gold Bio公司；7H9培养基(批号：4099145)、7H11琼脂粉(批号：5049644)购自美国碧迪医疗器械有限公司；Alamar Blue指示剂(批号：250714A)购自美国Bio-Rad公司；2× Long Taq PCR MasterMix购自北京睿博兴科生物工程有限公司，PCR引物合成及DNA测序工作由北京睿博兴科生物工程有限公司完成。

3.培养基、抗生素及培养条件：E.coliDH5α的培养使用LB培养基，结核分枝杆菌的固体培养使用7H11培养基、液体培养使用7H9培养基；均于37 ℃条件培养。卡那霉素终浓度为0.05 g/L，氨苄青霉素终浓度为0.1 g/L。

4.目的基因的PCR扩增：以pMV306hsp+FFLuc质粒为模板，设计合成引物FFLuc(5′-GTTAAGCCGGAATTCGGATCCAGAAGG-3′)，FFLuc(5′-GCGAAGCTTGAGTCACTTGCCTCCTTTC-3′)由北京睿博兴科生物公司合成，上下游引物分别含有EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位点。通过PCR获取报告基因FFLuc，PCR反应条件为预变性94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，64.2 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。

5.目的基因的TA克隆：切胶回收PCR产物，克隆到T-Vector pMDl9(Simple)上，转化至E.coliDH5α感受态细胞，同时对结果进行初步鉴定正确后送至公司测序，并命名为T+FFLuc。

6.T+FFLuc与质粒pMV36l的酶切、纯化、连接及转化：限制性内切酶EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ于37 ℃分别对T+FFLuc及pMV361进行双酶切4 h，将双酶切产物琼脂糖凝胶电泳并切胶回收目的DNA片段，4 ℃连接双酶切产物过夜并转化E.coliDH5α感受态细胞后培养过夜，同时对转化后的质粒进行双酶切鉴定，并命名为pMV361+FFLuc。

7.重组结核分枝杆菌菌株的构建：每200 μl结核分枝杆菌感受态细胞加5 μl重组质粒，进行电转化(电转参数：2.5 kV/cm，25 μF，1000 Ω)，电转后37 ℃培养箱中培养20 h，取100 μl菌液涂布于含有卡那霉素50 μg/ml的7H11平板上，37 ℃培养3～4周。

8.重组结核分枝杆菌菌株的鉴定：挑取7H11平板上的单个菌落，接种于含卡那霉素50 μg/ml的20 ml 7H9液体培养基，37 ℃静置培养14 d，取200 μl 培养至对数生长期的重组结核分枝杆菌菌液加至黑色96孔板中，再加入10 μl浓度为3 mg/ml D-Luciferin Potassium Salt，小动物活体成像选用生物发光模式进行摄影。

9.绘制重组结核分枝杆菌生长曲线：将空白结核分枝杆菌和重组结核分枝杆菌分别接种于7H9培养液中，37 ℃培养，每隔3 d测定1次培养物波长570 nm处的吸光度值(A570值)， 并绘制生长曲线。

10.绘制重组结核分枝杆菌菌株浓度与相对荧光强度关系曲线：检测培养至对数期的重组结核分枝杆菌的A570值，将其10倍连续稀释，共稀释5次。从不同浓度的混合液中分别取200 μl移入黑色96孔板中，检测相对荧光强度。

11.抗结核药物作用下FFLuc重组表达结核分枝杆菌菌株相对荧光强度检测：(1)96孔板中药物终浓度设置见表1。(2)在96孔板每孔加入98 μl 7H9培养基、2 μl药物、100 μl[1×106菌落形成单位(CFU)/ml]实验菌株。其中在96孔板中设置200 μl 7H9培养基，200 μl菌液的对照。(3)在加入药物后0、2、3、4、6 d检测相对荧光强度。(4)根据实验数据确定应用重组表达FFLuc结核分枝杆菌菌株测定MIC的标准。

12.MABA测定药物MIC：(1)96孔板中药物终浓度设置见表1。(2)在96孔板每孔加入98 μl 7H9培养基、2 μl药物、100 μl(1×106CFU/ml)实验菌株。其中在96孔板中设置200 μl 7H9培养基，200 μl菌液的对照。(3)7 d后向各孔加入20 μl 10×Alamer blue和12.5 μl 20%吐温-80的混合液。(4)37 ℃孵育24 h，同时记录各孔的颜色，蓝色表示细菌无生长，粉色表示有生长。MIC定义为阻

止颜色变化(从蓝色变为粉红色)的最低的药物浓度。

结 果

1.T+FFLuc双酶切鉴定：筛选阳性克隆菌，通过对质粒进行酶切鉴定得到与目的基因大小相近的特异性片段，使用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后可得到T载体片段为2692 bp和目的基因片段为1693 bp。

2.pMV361+FFLuc双酶切结果：EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后得到载体片段为4445 bp和目的基因片段1693 bp，初步认定重组质粒pMV361+FFLuc构建成功。

3.诱导重组结核分枝杆菌表达FFLuc基因：在培养至对数期的200 μl菌液中加入D-Luciferin Potassium Salt，小动物活体成像仪拍摄，发现荧光信号，证明重组结核分枝杆菌构建成功。

4.重组结核分枝杆菌的生长曲线：如图1所示，转入pMV361质粒，pMV361+FFLuc质粒的重组结核分枝杆菌的生长曲线与未转入质粒的结核分枝杆菌相比，均在18 d达到稳定期，但生长速度较慢。

图1 重组结核分枝杆菌生长曲线

5.重组结核分枝杆菌菌株浓度与相对荧光强度关系曲线：如图2所示，重组菌株浓度与相对荧光强度呈线性关系，随菌株浓度的增加相对荧光强度增强，r2值为0.994，回归方程为lg(y)=0.905×lg(x)+0.832。

表1 抗结核药物在96孔板中的药物浓度分布情况(μg/ml)

图2 不同浓度的重组结核分枝杆菌相对荧光强度

6.MIC测定结果对比：图3为重组表达FFLuc 结核分枝杆菌菌株分别在0、2、4、6 d测定7种抗结核药物不同药物浓度下的荧光检测结果。定义相对荧光强度降低1个log值为MIC值。MIC实验均重复进行4次，取其中位数为最终结果。将应用结核分枝杆菌pMV361+FFLuc菌株的MIC测定结果与MABA法的结果对比分析，如表2所示。实验结果±(1～2)倍MIC值视为可接受范围，其中，所有药物用重组结核分枝杆菌检测的MIC值在药物作用后第4天即可检测在可接受范围的MIC值结果，而MABA法大致需要7～9 d才可得出结果。

讨 论

因结核分枝杆菌生长缓慢的特性，抗结核新药的药效学评价在时间上受到很大限制。开发重组结核分枝杆菌用于快速检测一直是研究的热点与难点。生物发光与荧光成像均已用于结核病的研究中[6-10]，但荧光成像自身背景信号的干扰使其信噪比低。生物发光的原理是通过酶促反应产生光，运用生物发光技术可以快速高效检测细胞的新陈代谢功能，并可在药物筛选试验中作为一种细胞活力的间接标记物[4]。

A～G图分别为异烟肼(INH)、利福平(RFP)、莫西沙星(Mfx)、乙胺丁醇(EMB)、链霉素(Sm)、左氧氟沙星(Lfx)、利奈唑胺(Lzd)等7种药物在0、2、4、6 d时不同药物浓度下测定的相对荧光强度。各点对应的药物浓度请参照表1

图3荧光检测法检测各种抗结核药物对重组结核分枝杆菌的MIC值

表2 MABA法和荧光检测法检测不同抗结核药物对重组结核分枝杆菌的MIC值(μg/ml)

注通过4次独立实验取其中位数作为MIC值结果，括号内数值表示MIC数值范围(最小值～最大值)

萤火虫荧光素酶成像属于生物发光实验，是在ATP、镁离子(Mg2+)和氧气的参与下，注射的底物荧光素与表达的荧光素酶反应，进而产生生物发光的光子。细菌的荧光素酶由luxAB基因编码，它的优势在于可自发荧光而不需额外添加底物。但是由于底物荧光素无毒、易于添加，并且其荧光信号强于细菌荧光素酶产生的自发荧光，所以本研究选用了萤火虫荧光素酶。最初，FFLuc被用于检测ATP含量，其作为一种间接的检测方法以检测细胞活力和数目[11-12]。由于结核分枝杆菌生长周期长，与传统菌落计数的方法相比，运用生物发光进行标记以检测抗结核药物更具优势[13]。

本研究选用pMV361作为载体，因其为可用于大肠杆菌与结核分枝杆菌的一种穿梭载体，所以可以此质粒作为载体构建重组质粒。将FFLuc基因克隆至pMV361，构建pMV361+FFLuc，经酶切验证后电转至结核分枝杆菌，通过荧光检测证明重组菌株可有效表达萤火虫荧光素酶。研究中选用的FFLuc基因是经过优化的基因，其包含一段优化的SD序列(Shine-Dalgarno sequence)，可增强荧光素酶的表达，与野生型FFLuc基因相比，荧光信号强约30倍[13]。实验中发现，重组菌株的生长状态明显影响相对荧光强度，同一浓度下处于对数生长期的重组菌株相对荧光强度比稳定期的重组菌株相对荧光强度大，这可能是由于对数生长期的菌株ATP生成增加，而生物发光的酶促反应过程需要ATP。外源质粒的存在，对宿主菌是一种代谢负担，所以重组结核分枝杆菌与结核分枝杆菌相比生长较慢。但是转入pMV361质粒，pMV361+FFLuc质粒的重组结核分枝杆菌的生长动力学相似，说明FFLuc的基因表达不会影响重组结核分枝杆菌的生长。

本研究成功构建了表达萤火虫荧光素酶的重组结核分枝杆菌，并建立了一种简单快捷的体外筛选抗结核药物的方法，其结果与传统方法的结果具有一致性，新的方法所需时间更短。因MABA法检测需要菌株生长到一定浓度以达到检测限进而区分红色孔与蓝色孔，所以一般需要7～9 d才可判读结果。另外，MABA检测MIC的方法需加入染料，根据染料颜色的变化进行判断，若是有杂菌污染则会出现跳孔等现象而影响结果的判读。荧光检测方法是根据萤火虫荧光素酶与底物结合后产生的相对荧光强度变化进而判断药物MIC值，其特异性强，受杂菌污染的影响小。因MIC的定义为抑制90%的细菌生长，并依据相对荧光强度与菌量间的线性关系，可定义加药后的相对荧光强度与0 d相比降低1个 log值，则该药物浓度为此药物的MIC。因其无需待细菌生长达到检测线后再进行检测，故缩短了检测时间。

本研究的局限性在于外源质粒导入结核分枝杆菌会有质粒丢失。国外研究中构建了整合酶缺失的重组表达FFLuc的质粒，并将其电转至结核分枝杆菌中，发现其稳定性有明显提高，无抗生素条件下体外培养3个月仍有>99%的菌落有荧光表达。而pMV306G13+FFLuc重组质粒同条件下约有40%的菌落丢失质粒而无荧光表达[14]。本研究中构建的重组质粒在无抗生素条件下，液体培养27 d质粒丢失，未检测到荧光，而7H11固体培养1个月后仍可检测到荧光。在本研究中，发现在有抗生素筛选的情况下，重组结核分枝杆菌在固体培养基上传代至6代仍可检测到荧光，所以在有抗生素筛选的情况下质粒的稳定性是良好的。此外，无抗生素体外液体培养27 d未检测到荧光，并不一定完全是质粒丢失导致，也可能是因缺少了抗生素的压力，未携带质粒的菌生长较携带质粒的菌生长有优势，一定程度上抑制了携带质粒菌的生长。又因体外培养27 d，已进入结核分枝杆菌生长的非复制期，相较于对数生长期来说，ATP的减少也会对生物发光产生一定影响。本研究主要是将其用于抗结核药物的快速药效学筛选，培养仅需4～7 d，时间短，质粒丢失、未携带质粒菌的生长和ATP的减少并不明显，但需使用对数生长期的菌株，以保证ATP的供应。

本方法的建立为下一步开展体内药物筛选试验奠定了基础，体内药物筛选对临床前药物评价是必须的，使用表达FFLuc的重组结核分枝杆菌建立动物模型，可快速评估抗结核药物的疗效，对动物的损伤小。并且可同时对5只小鼠进行生物发光模式摄影，成像时间短，适用于大规模药物筛选试验。

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TheresearchofconstructingtherecombinantMycobacteriumtuberculosisstrainexpressingFFLucandapplyingittodetermineminimalinhibitoryconcentration

LIYuan-yuan,CHENXi,WANGBin,FULei,ZHUHui,LUYu.

BeijingKeyLaboratoryofDrugResistanceTuberculosisResearch;DepartmentofPharmacology,BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute;BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

Correspondingauthor:LUYu,Email:luyu4876@hotmail.com

ObjectiveTo construct the recombinantMycobacteriumtuberculosis(MTB) strain that expresses stably high levels of firefly luciferase, and establish the method of detecting minimum inhibitory concentration (MIC) by using the recombinant MTB strain.Methods(1)FFLucgene (the firefly luciferase encoding gene) was cloned by PCR with the plasmid pMV306hsp+FFLuc as a template. Then, the recombinant expression vector plasmid pMV361+FFLuc was constructed and transformed into H37Rv (a MTB strain) competent cells by the electro transformation method. The expression of FFLuc was tested by theinvivoimaging system (IVIS) spectrum. Finally, the growth of MTB and recombinant MTB were compared and the growth curves were drawn. (2) The fluo-rescence quantity under different concentrations of isonicotinyl hydrazide (INH), rifampin (RFP), ethambutol (EMB), moxifloxacin (Mfx), streptomycin (Sm), levofloxacin (Lfx), and Levofloxacin (Lzd) in different time was detected, in order to analyze the effect of different drugs on stabilization of FFLuc expression and establish the method of detecting MIC on the basic of the recombinant MTB stain that expresses FFLuc. In addition, the MICs of the seven drugs were tested.Results(1) The density of the recombinant MTB strain was linearly related to the fluorescent expression of FFLuc in the recombinant expression vector pMV361+FFLuc (r2=0.994, lg(y)=0.905×lg(x)+0.832). (2) The detected MICs were similar to those obtained by conventional Micro-plate Alamar Blue Assay (MABA) method. The MICs of INH, RFP, Mfx, EMB, Sm, Lfx, and Lzd detected on the fourth day by the new method were 0.05, 0.05, 0.09375, 4, 0.8, 0.15, and 0.15 μg/ml, respectively. Compared with the results obtained by the MABA method, changes in MICs were in the range of ±(1-2) times of MIC, which were acceptable.ConclusionWe established a MIC detection method by using recombinant MTB stain harboring FFLuc. Compared with the MABA method, the established MIC detection method is shorter time consuming, and we could get the results on the fourth day.

Mycobacteriumtuberculosis; Microbial sensitivity test; DNA, recombinant; Luciferases, firefly

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.11.009

“十二五”国家科技重大专项(2015ZX09102007-015)；北京市医院管理局“登峰”计划(DFL20151501)

101149 首都医科大学附属北京胸科医院 耐药结核病研究北京市重点实验室 北京市结核病胸部肿瘤研究所药物研究室

陆宇，Email：luyu4876@hotmail.com

2017-08-24)

(本文编辑：李敬文)