玛咖乙醇提取物抗氧化活性的研究Δ

王 鑫，李 然，陈美玲，周世通，冀彦君，贾宝秀

(泰山医学院药学院，山东 泰安 271016)

·论著·

玛咖乙醇提取物抗氧化活性的研究Δ

王 鑫*，李 然，陈美玲，周世通，冀彦君，贾宝秀#

(泰山医学院药学院，山东 泰安 271016)

目的：研究不同提取工艺对玛咖乙醇提取物抗氧化活性的影响。方法：根据羟基自由基清除能力及超氧阴离子自由基清除能力来评价体外抗氧化成分的活性，分别考察提取溶剂、料液比、提取温度、超声提取时间等因素对玛咖乙醇提取物抗氧化能力的影响。结果：玛咖乙醇提取物有明显的体外抗氧化作用，当乙醇的体积百分比浓度为70%时，增加乙醇体积百分比浓度，其抗氧化能力增幅缓慢；当料液比>1∶30时，其抗氧化能力基本稳定；当提取温度升至70 ℃时，其抗氧化能力最强；当超声提取时间增至60 min时，超氧阴离子自由清除率达到最大，当提取时间增至90 min时，羟自由基清除率达到最大。结论：实验初步得出了最佳工艺条件，提取溶剂为70%的乙醇、料液比为1∶30、提取温度为70 ℃、超声提取时间为60 min，在此条件下所得玛咖乙醇提取物的抗氧化活性最好。

玛咖； 乙醇提取物； 抗氧化； 自由基

玛咖(LepidiummeyeniiWalp.Maca)是原产南美洲安第斯山脉的一种十字花科植物[1]，叶子椭圆，根茎形似小圆萝卜，可食用，是一种纯天然食品，营养成分丰富，有“南美人参”“秘鲁人参”的称号。玛咖对生长条件的要求非常苛刻，只适宜生长在高原山区高寒地带，要求昼夜温差≥30 ℃、雨量充沛的地方，这种独特的生长条件限制了玛咖的种植，而且其对土壤养分的“吸收力”极强，每收获一季，土地需要休养7年。我国从2003年开始从秘鲁引种玛咖，并成功在云南省种植，本研究所采用的玛咖正是产自云南省的黄色玛咖。玛咖中含有丰富的营养成分，研究结果显示，其能抗衰老[2]、改善性功能障碍[3]、抗疲劳[4-5]、减轻焦虑、调节血清中的激素分泌、降低血压等作用。玛咖的生理活性与其化学组成有着密切的关系，研究者认为与玛咖根中含有的蛋白质、氨基酸、还原糖，锌、铁、钙等矿物质及其主要次生代谢产物生物碱、芥子油苷和异硫氰酸酯、多酚、甾醇及其衍生物等有关[6-9]。玛咖在体内和体外都表现出明显的清除自由基、抑制过氧化物产生、提高动植物体内抗氧化酶活性的抗氧化作用[10-14]。本研究根据羟基自由基清除能力及超氧阴离子自由基清除能力来评价体外抗氧化成分的活性，分别考察了提取溶剂、料液比、提取温度、超声提取时间等因素对玛咖乙醇提取物抗氧化活性的影响，以期为玛咖的开发利用提供一定的参考价值。

1 材料

1.1仪器

TU-1800紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；TDL-60B型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化公司)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)

1.2药品与试剂

新鲜的玛咖块根(云南丽江市古城区南云百草生物科技有限公司提供)；硫酸盐铁、水杨酸、邻苯二酚、双氧水、乙醇等皆为分析纯；所有实验用水均为二次蒸馏水。

2 方法

2.1玛咖样品的处理

取新鲜的玛咖根茎，使用切片机将其切成片状，放入干燥箱中干燥至恒质量，粉碎机粉碎，过60目筛，得到玛咖粉末。

2.2玛咖乙醇提取液的制备

精确称取粉碎后的玛咖样品1.000 0 g，分别加入不同体积百分比浓度的乙醇30 ml。在设定的温度下，超声提取不同时间，以3 000 r/min离心一定时间后取滤液，滤渣再同法提取2次，合并3次提取的滤液。将滤液在40 ℃旋转蒸发仪中进行减压浓缩。将浓缩后的滤液用提取溶剂定容至25 ml，0.45 μm滤膜过滤后备用。

2.3玛咖乙醇提取物清除羟自由基能力测定

精密量取9 mmo1/L的FeS04溶液0.5 ml、9 mmo1/L的水杨酸-乙醇溶液0.5 ml置于10 ml试管中，加入不同体积的提取溶剂，并用提取溶剂补充至120 μl，然后加入提取溶剂2.8 ml，加8.8 mmo1/L双氧水0.5 ml启动反应，于37 ℃水浴下反应30 min，在510 nm波长处测量各浓度的吸光度，平行测量3次。

2.4玛咖乙醇提取物清除超氧阴离子自由基能力测定

采用邻苯三酚自氧化法测定玛咖乙醇提取物清除超氧阴离子自由基的活性，邻苯三酚在碱性条件下自氧化形成超氧阴离子自由基，生成有色中间产物，当有抑制剂存在时，可清除超氧阴离子自由基，从而阻止中间产物的积累，由此可通过比色法检验物质清除超氧阴离子自由基的能力。于0.05 mol/L的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液(pH=8.0，含1 mmol/L的乙二胺四乙酸)4.5 ml中加入不同体积样品溶液，提取溶剂补充至4.6 ml，混匀后置于25 ℃水浴中预热20 min，再加入6 mmol/L的邻苯三酚溶液0.2 ml(以10 mmol/L的盐酸配制)，迅速混匀并计时，以10 mmol/L的盐酸为参比，在波长325 nm处每隔30 s测定反应体系的吸光度，共记录前4 min的结果。

2.5数据处理

2.5.1 羟基自由基清除率计算方法：羟基自由基清除率(%)=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%。式中，A0为未加样品(以提取溶剂代替样品)的空白对照液吸光度；Ai为加入玛咖乙醇提取物后反应体系的吸光度；Aj为不加过氧化氢的玛咖乙醇提取物(以蒸馏水代替过氧化氢)本底的吸光度。

2.5.2 超氧阴离子自由基清除率计算方法：计算吸光度随时间的变化值，以吸光度对时间做线性校正，其斜率即为邻苯三酚自氧化速率或样品自氧化速率。超氧阴离子自由基抑制率(%)=(1-样品自氧化速率/空白自氧化速率)×100%。

3 结果与分析

3.1乙醇体积百分比浓度对提取液抗氧化活性的影响

按照“2.2”“2.3”“2.4”项下方法，考察不同体积百分比浓度乙醇对提取液抗氧化活性的影响。结果显示，随着乙醇体积百分比浓度的增加，提取液清除羟自由基及超氧阴离子自由基的能力都有所增加，在一定程度上表明抗氧化成分在高体积百分比浓度乙醇溶液中的溶出效果更好；当乙醇的体积百分比浓度为70%时，增加体积百分比浓度，提取液抗氧化能力增幅缓慢，故选择最佳乙醇体积百分比浓度为70%，见图1。

图1 乙醇体积百分比浓度对提取液抗氧化活性的影响(提取液质量浓度40 mg/mL、料液比1∶30、提取温度50 ℃、提取时间30 min)Fig 1 Effects of concentration of ethanol volume percentage on antioxidant activity of ethanol extract of maca (C=40 mg/ml，the solid-liquid ratio was 1∶30，T=50 ℃，t=30 min)

3.2料液比对提取液抗氧化活性的影响

提取液的抗氧化能力随着液体比例的增加先增大后减小，当料液比>1∶30时，提取液的抗氧化能力基本稳定，见图2。提取溶剂过少，提取不充分导致提取率较低；但溶剂过多使样品浓度降低不利于提取，并且过多的溶剂会带来后续溶剂回收成本过高的问题，因此，最佳提取料液比控制在1∶30左右为宜。

3.3提取温度对提取液抗氧化活性的影响

随着提取温度的升高，提取液抗氧化能力随之增强，当温度升至70 ℃时，提取液抗氧化能力最强，故最佳提取温度设定为70 ℃，见图3。

图3 提取温度对提取液抗氧化活性的影响(提取液质量浓度40 mg/ml、乙醇体积百分比浓度60%、料液比1∶30、超声提取时间30 min)Fig 3 Effects of extraction temperature on antioxidant activity of ethanol extract of maca(C=40 mg/ml，CC2H5OH=60%，the solid-liquid ratio was 1∶30，t=30 min)

图4 超声提取时间对提取液抗氧化活性的影响(提取液质量浓度40 mg/ml，乙醇体积百分比浓度60%，料液比1∶30，提取温度50 ℃)Fig 4 Effects of ultrasonic extraction time on antioxidant activity of ethanol extract of maca(C=40 mg/ml，CC2H4OH=60%，the solid-liquid ratio was 1∶30，T=50 ℃)

3.4超声提取时间对提取液抗氧化活性的影响

本研究采用超声提取的方法，随着提取时间的增加，提取液抗氧化能力逐渐增强，提取时间为30 min时，羟自由基清除率和超氧阴离子自由清除率分别为34.5%和19.7%；提取时间增至60 min时，超氧阴离子自由清除率达到最大；提取时间增至90 min时，羟自由基清除率达到最大，见图4。考虑到增加提取时间会增加成本及能耗，故最合适的提取时间应选择60～90 min。

3.5提取液质量浓度与其抗氧化活性的关系考察

通过以上对各实验条件的考察，得到最优提取条件：提取溶剂为70%的乙醇，料液比为1∶30，提取温度为70 ℃，超声提取时间为60 min。在此条件下测定不同质量浓度乙醇提取液的抗氧化活性，结果显示，随着提取液质量浓度(C)的增加，羟自由基和超氧自由基清除率均随之线性增强，线性方程分别为：羟自由基清除率(%)=22.201 7C(mg/ml)+0.415 7(R=0.997)；超氧自由基抑制率(%)=3.692 8C(mg/ml)+0.403 8(R=0.995)，见图5。

图5 提取溶液浓度与清除率的线性关系(乙醇体积百分比浓度70%、料液比1∶30、提取温度70 ℃、超声提取时间60 min)Fig 5 The linear relationship between the concentration and the clearance rate(CC2H4OH=70%，the solid-liquid ratio was 1∶30，t=60 min，T=70 ℃)

4 结论

本研究通过体外抗氧化的方法，根据羟基自由基清除能力及超氧阴离子自由基清除能力来评价体外抗氧化成分的活性，分别考察了提取溶剂、料液比、提取温度、超声提取时间等因素对玛咖乙醇提取物抗氧化能力的影响。结果显示，玛咖乙醇提取物有明显体外抗氧化活性，且在不同提取溶剂、料液比、提取温度、超声提取时间下其抗氧化活性有所不同。实验初步得出了最佳工艺条件：提取溶剂为70%的乙醇，料液比为1∶30，提取温度为70 ℃，超声提取时间为60～90 min，在此条件下所得玛咖乙醇提取物的体外抗氧化活性最好。

[1]Valerio LG Jr，Gonzales GF.Toxicological aspects of the South American herbs cat’s claw(Uncariatomentosa) and Maca(Lepidiummeyenii): a critical synopsis[J].Toxicol Rev，2005，24(1)：11-35.

[2]余龙江，张永忠，金文闻，等.玛咖醇提取物对小鼠的抗衰老作用[J].中草药，2006，37(1)：81-83.

[3]曹东，薛润光，顾鉴秋.丽江玛咖不同提取物对小鼠性行为及性激素的影响[J].云南中医中药杂志，2012，33(9)：53-54.

[4]赵裕虎，曹建民，郭娴，等.玛咖对运动训练大鼠睾酮及相关激素和抗疲劳能力的影响[J].中国实验方剂学杂志，2014，20(23)：164-168.

[5]高玉秋，李彬，王彦武，等.玛咖片缓解体力疲劳功能的实验研究[J].中国食物与营养，2014，20(8)：76-78.

[6]Wang YL，Wang YC，Mcneil B，et al.Maca: An Andean crop with multi-pharmacological functions[J].Food Research International，2007，40(7)：783-792.

[7]艾中，程爱芳，孟际勇，等.国产玛咖芥子油苷的组分分析和含量测定[J].食品科技，2012，37(4)：182-186.

[8]余龙江，金文闻.国际良种：药食两用植物MACA[M].武汉：华中科技大学出版社，2003：2-10.

[9]甘瑾，玛颖，何钊，等.云南栽培3种颜色玛咖中总生物碱含量分析[J].食品科学，2010，31(24)：415-419.

[10] 孙晓东，唐辉，杜萍，等.丽江玛咖的营养成分分析及多糖体外的抗氧化作用[J].光谱实验室，2013，30(5)：2365-2371.

[11] 罗堾子，张弘，郑华，等.玛咖浸泡酒工艺研究[J].食品科学，2012，33(2)：164-168.

[12] 张维，张铁，王伟伟，等.云南种植玛咖不同部分化学成分和抗氧化活性分析[J].天然产物研究与开发，2014，26(6)：813-818.

[13] 何钊，冯颖，徐珑峰，等.云南种植玛咖乙醇提取物的体外抗氧化活性分析[J].食品科学，2010，31(15)：39-43.

[14] 张永忠，余龙江，金文闻，等.玛咖多糖抗氧化保健作用研究[J].食品科技，2005(8)：97-99.

StudyonAntioxidantActivityofEthanolExtractofMacaΔ

WANG Xin, LI Ran, CHEN Meiling, ZHOU Shitong, JI Yanjun, JIA Baoxiu

(College of Pharmaceutical, Taishan Medical University,Shandong Tai’an 271016, China)

OBJECTIVE: To study the effects of different extraction technology on antioxidant activity of ethanol extract of maca. METHODS: Activity of in vitro antioxidant compound was evaluated according to free radical-scavenging of hydroxy and superoxide anion, and effects of extraction solvent, solid-liquid ratio, extraction temperature and ultrasonic extraction time on antioxidant activity of ethanol extract of maca were respectively inspected. RESULTS: Ethanol extract of maca had obvious in vitro antioxidant effects, the antioxidant capacity decreased accompanied with the increasing of the ethanol volume percentage when the concentration of ethanol volume percentage of ethanol was 70%. The antioxidant capacity was stable when the solid-liquid ratio was>1∶30. The antioxidant capacity was the strongest when extraction temperature was 70 ℃. The free radical-scavenging of superoxide anion took the lead when the ultrasonic extraction time increased to 60 min, yet the free radical-scavenging of hydroxy took the lead when the ultrasonic extraction time increased to 90 min. CONCLUSIONS: The optimum technological conditions are obtained after preliminary experiment: ethanol extraction solvent of 70%, solid-liquid ratio of 1:30, extraction temperature of 70 ℃ and ultrasonic extraction time of 60 min. Under the condition, the antioxidant activity of maca extraction is the best.

Maca; Ethanol Extract; Antioxidant; Free radicals

R97

A

1672-2124(2017)09-1172-04

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.09.008

国家级大学生创新创业计划项目(No.201510439072)；泰安市科技发展计划项目(No.201540707)

*本科生。研究方向：制药工程。E-mail：123340653@qq.com

#通信作者：副教授，硕士。研究方向：药物分析。E-mail：bxjia@tsmc.edu.cn

2017-04-07)