巴西橡胶树WRKY转录因子基因HbWRKY41的克隆与表达分析

刘 辉，韦永选，邓 治，代龙军，杨 洪，李德军

(中国热带农业科学院 橡胶研究所，农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，海南 儋州 571737)

巴西橡胶树WRKY转录因子基因HbWRKY41的克隆与表达分析

刘 辉，韦永选，邓 治，代龙军，杨 洪，李德军

(中国热带农业科学院 橡胶研究所，农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，海南 儋州 571737)

为阐明巴西橡胶树WRKY转录因子基因HbWRKY41的分子特征及表达特性，利用RT-PCR方法从巴西橡胶树中克隆了该基因。HbWRKY41开放阅读框1 020 bp，编码339个氨基酸，预测蛋白分子量为38.48 kDa，理论等电点为5.52。HbWRKY41含有1个WRKY保守结构域和1个C2HC型锌指结构，与蓖麻、棉花、大豆及拟南芥WRKY41蛋白聚为一类，属于Ⅲ类 WRKY 转录因子家族成员。实时荧光定量PCR检测结果表明，HbWRKY41在巴西橡胶树根、树皮、胶乳、叶和花等组织中均有表达，以在衰老叶片中的表达最高，而在胶乳和树皮中的表达相对较低。干旱、低温及高盐胁迫均可上调HbWRKY41的表达，其中以低温或盐胁迫下HbWRKY41的表达持续升高。HbWRKY41可能在巴西橡胶树叶片衰老和非生物胁迫应答中起着重要调控作用。

巴西橡胶树；WRKY转录因子；基因克隆；表达分析；非生物胁迫

WRKY转录因子是植物特有的一类转录因子，其名称源于一段高度保守的WRKY结构域，由约60个氨基酸残基组成。该结构域N端具有极其保守的WRKYGQK氨基酸序列，C端通常有锌指结构(Zinc-finger motif)，能通过与启动子区域的W-box(TTGACT/C)等顺式作用元件结合来调节下游目标基因的表达[1-2]。根据WRKY 结构域数量和锌指结构类型，WRKY转录因子被分为3类(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)[1]。Ⅰ类WRKY转录因子WRKY结构域的数目为2，锌指结构类型为C2H2(Cx4-5Cx22-23HxH)，如桃PpWRKY1[3]；Ⅱ和Ⅲ类都只含有1个WRKY结构域，不同的是Ⅱ类的锌指结构类型为C2H2(Cx4-5Cx22-23HxH)，而Ⅲ类的锌指结构类型为C2HC(Cx7Cx23HxC)，如苹果MdWRKY25(Ⅱ)和MdWRKY116(Ⅲ)[4]。根据氨基酸核心序列差异，Ⅱ类又划分为5亚组：Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe[5]。

植物WRKY转录因子在许多生物进程中发挥重要调控作用，包括生长发育、代谢、生物及非生物胁迫应答等[1-2，5-6]，如AtWRKY46、AtWRKY54和AtWRKY70正调控拟南芥生长发育，负调控干旱胁迫应答[7]；过表达GmWRKY31能提高大豆对疫霉病的抗性[8]。鉴于WRKY转录因子的重要生物学功能，该基因家族已经在许多植物物种中被鉴定出来，如桃[3]、苹果[4]、胡萝卜[9]等。巴西橡胶树含有81个WRKY基因[10]，但仅有少数几个有进一步的研究报道，包括HbWRKY1[11-12]、HbWRKY3[13]、HbWRKY9[14]、HbWRKY27[15]、HbWRKY75[16]HbWRKY7和HbWRKY11[17]等。通过对巴西橡胶树转录组数据进行分析，本研究获得了一个WRKY基因序列，本研究从巴西橡胶树中克隆了该基因(HbWRKY41)，并分析了其分子特性及表达特征，以期为下一步解析其生物学功能提供参考。

1 材料和方法

1.1植物材料与处理

本研究所使用的组织样品均采自巴西橡胶树品系热研7-33-97，除根采自培育6个月的组培苗外，其他组织样品(成熟叶、衰老叶、茎尖、雄花、雌花、胶乳和树皮)均采自中国热带农业科学院试验农场1990年定植的巴西橡胶树。每份组织样品3个生物学重复，每份样品采自3株巴西橡胶树。样品采集后液氮速冻，-80 °C保存。

非生物胁迫处理材料为移栽培养6个月的组培苗。低温处理在4 °C人工气候箱中进行；干旱和盐胁迫处理是将植株从育苗袋中取出，洗净栽培基质，根部浸没于30% PEG6000或1 mol/L NaCl 溶液中。低温和干旱胁迫处理分别在0(对照)，3，6，12，24，48 h采集第2，3片叶，盐胁迫在0(对照)，4，24，48 h采集第2，3片叶。以上各处理时间点均设3次生物学重复，每重复4株组培苗。样品采集后液氮速冻，用于总RNA提取。

1.2总RNA提取、反转录及HbWRKY41基因克隆

采用通用植物总RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)和PrimeScript®RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa)提取各样品总RNA，并反转录合成第一链cDNA，具体方法参照说明书。

从GenBank下载登录号为AJJZ011014562.1的序列，采用SoftBerry网站中的FGENESH程序 (http：//linux1.softberry.com/berry.phtml)预测基因ORF(Open reading frame，开放阅读框)。根据基因预测结果，通过Primer 3(http：//primer3.ut.ee/)在线程序设计扩增ORF的特异性引物(5′-ATGGATA

GTTGTTGGAACTTGG-3′和5′-TTAAGAGAAAAATCC

TGGCATG-3′)。目标基因PCR扩增的反应总体系25 μL，含5 μL 5×TransStart®FastPfu Buffer、0.5 μL TransStart®FastPfu DNA Polymerase(2.5 U/μL)、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、1 μL各组织等量混合的cDNA模板、0.5 μL正向引物(10 μmol/L) 、0.5 μL反向引物(10 μmol/L)以及15.5 μL ddH2O。PCR反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，40个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，采用胶回收试剂盒(OMEGA)回收纯化目标片段，并与pEASY®-Blunt Simple Cloning Vector(北京全式金生物技术有限公司)连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，PCR筛选阳性克隆送赛默飞世尔科技有限公司广州分公司测序。

1.3HbWRKY41序列及进化分析

使用DNAMAN 4.0软件推导HbWRKY41基因编码氨基酸序列。蛋白等电点和分子量预测采用在线程序Compute pI/Mw(http：//web.expasy.org/compute_pi/)；蛋白保守结构域预测使用InterProScan(http：//www.ebi.ac.uk/interpro/)；采用NCBI BlastP进行蛋白序列比对分析，并下载不同物种不同类型的WRKY转录因子，使用MEGA 6.0软件构建系统进化树，算法选用Neighbor-Joining，Bootstrap重复次数为1 000。

1.4实时荧光定量PCR分析

使用Primer 3程序设计HbWRKY41和内参基因HbUBC4的实时荧光定量PCR(qPCR)引物。HbWRKY41 qPCR正、反向引物序列分别为5′-GAAGGA

CCCCATGATGACGG-3′和5′-TGTAGCCCAGCAGTTC

AAGG-3′；HbUBC4 qPCR正、反向引物序列分别为5′-TCACCCTGAACCTGATAGCC-3′和5′-TTTCTTTGG

TGACGCTGCAA-3′。qPCR反应体系如下：SYBR®Premix Ex TaqTM(2×) (TaKaRa)10 μL，正、反向引物各1 μL，模板2 μL，补ddH2O至20 μL。每样品3次重复。qPCR在Bio-Rad CFX96 qPCR 仪进行，程序设置为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40个循环后进行溶解曲线分析，以确定引物的特异性。2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达量。

1.5数据统计分析

使用SigmaPlot 12.0软件进行数据处理和作图，数据结果为3次生物学重复的平均值±标准误。采用t-test进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1HbWRKY41蛋白序列特征

通过对巴西橡胶树树皮转录组测序数据进行分析，获得了一个WRKY基因部分序列。利用该序列对NCBI中巴西橡胶树相关的基因组和转录组数据库进行比对分析，本研究获得了包含完整ORF的基因序列，GenBank登录号为AJJZ011014562.1。根据该序列，设计扩增全长ORF的特异引物，并通过PCR从巴西橡胶树品系热研7-33-97中克隆了该基因(图1)。琼脂糖凝胶电泳、测序分析及基因预测结果表明，该基因ORF长度为1 020 bp，编码339个氨基酸。蛋白序列比对表明，该蛋白与蓖麻、棉花、大豆及拟南芥等WRKY41蛋白序列一致性较高。故将该基因命名为HbWRKY41。

M.DNA分子质量标志物DL2000；N.空白对照；H.HbWRKY41。M.DL2000 DNA Marker；N. Negative control；H. HbWRKY41 PCR product.

预测HbWRKY41蛋白分子量为38.48 kDa，理论等电点为5.52。蛋白保守结构域预测结果表明，HbWRKY41在130-191位氨基酸之间拥有一个由62个氨基酸组成的WRKY结构域，含有一段高度保守的WRKYGQK七肽序列；同时含有C2HC型(Cx7Cx23HxC)锌指结构(图2)。以上结果表明，HbWRKY41属于Ⅲ类WRKY转录因子家族成员。此外，HbWRKY41含有核定位信号基序(KKRK)，位于107-110位氨基酸 (图2)。

单下划线部分为WRKY结构域；灰色背景标出的为保守的WRKYGQK七肽序列；双下划线标出的为核定位信号基序；三角形标出的为锌指结构的C和H残基。

The single underlined region indicate WRKY domain；The conserved WRKYGQK amino acids are showed in gray background；The double underlined region indicate the nuclear localization signal；The C and H residues in the zinc-finger motif are marked by a triangle.

图2HbWRKY41全长ORF序列及其推导的氨基酸序列
Fig.2Full-lengthORFsequenceanddeducedaminoacidsofHbWRKY41

2.2HbWRKY41系统进化分析

为解析HbWRKY41与其他植物WRKY转录因子的系统进化关系，采用MEGA 6.0软件构建了HbWRKY41和其他植物WRKY转录因子的系统进化树。如图3所示，植物WRKY蛋白分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类，其中Ⅱ类又进一步分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd 和Ⅱe 5 个亚类，这与前人对WRKY转录因子的分类结果一致。HbWRKY41与蓖麻(RcWRKY41)、棉花(GhWRKY41)、大豆(GmWRKY41)及拟南芥(AtWRKY41)划为一类，同属于Ⅲ类WRKY转录因子家族成员。

2.3HbWRKY41的组织表达特性

采用qPCR分析了HbWRKY41在橡胶树胶乳、树皮、根、茎尖、成熟叶、衰老叶、雄花和雌花等组织中的表达。如图4所示，HbWRKY41在以上各组织中均有表达，但是在不同组织中的表达存在明显差异。以在衰老叶片中的表达量最高，其次是茎尖。胶乳和树皮中HbWRKY41的表达相对较低。

2.4HbWRKY41的表达受非生物胁迫诱导

为探究HbWRKY41在橡胶树非生物胁迫响应中的作用，采用qPCR分析了低温、干旱及高盐胁迫下，叶片中HbWRKY41基因的表达变化。PEG诱导

的干旱胁迫下，HbWRKY41的表达逐步升高，在处理6 h，达到最高值，较处理前(0 h)上调29.3倍；此后，HbWRKY41的表达逐步降低，处理48 h，HbWRKY41的表达恢复到胁迫处理前的正常水平(图5)。低温胁迫下，HbWRKY41的表达持续升高；处理6 h后，其表达量均极显著高于处理前；处理48 h，HbWRKY41的表达较胁迫处理前上调117.7倍(图5)。盐胁迫下，HbWRKY41的表达持续升高，在各处理时间点的表达均极显著高于胁迫处理前，处理48 h，HbWRKY41的表达较胁迫处理前上调317.5倍(图6)。以上结果表明，HbWRKY41的表达受低温、干旱和高盐等非生物胁迫强烈诱导。

图3 进化树分析HbWRKY41与其他植物WRKY转录因子的进化关系Fig.3 Phylogenetic tree showing the evolutionary relationship between HbWRKY41 and other plant WRKY transcription factors

图4 巴西橡胶树HbWRKY41基因的组织表达谱分析Fig.4 Tissue expression pattern analysis of HbWRKY41 gene in Hevea brasiliensis

**.处理与对照(0 h)在0.01水平上差异显著。图6同。**. Significant difference at P<0.01 level between the treatment and control (0 h) groups.The same as Fig.6.

图6 盐胁迫下HbWRKY41的表达模式Fig.6 Expression pattern of HbWRKY41 under salt stress

3 讨论

WRKY转录因子是植物特有的一类转录因子，被分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3大类。橡胶树基因组中含有81个WRKY转录因子，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类的数目分别为16，51，14[10]。本研究克隆的HbWRKY41含有典型的WRKY保守结构域和C2HC型锌指结构，属于Ⅲ类WRKY转录因子。序列比对及进化分析表明，HbWRKY41同拟南芥、蓖麻、棉花、大豆等的WRKY41蛋白同源性较高，处于同一进化分支。Ding等[18]研究证实，拟南芥AtWRKY41通过直接调控ABI3(Abscisic acid Insensitive 3)的表达调控种子休眠。棉花GhWRKY41则通过调控气孔关闭和抗氧化相关基因的表达正调控植物的耐盐和抗旱性[19]。HbWRKY41是否具有类似于AtWRKY41或GhWRKY41的功能仍需通过基因工程手段进一步研究。

WRKY转录因子在植物叶片衰老中发挥重要调控作用。转录组分析表明，WRKY转录因子是参与拟南芥叶片衰老调控的第二大类转录因子，仅次于NAC转录因子[5]。近年来，利用正向和反向遗传学等方法分离鉴定的许多调控植物衰老的WRKY基因，如OsWRKY42[20]、AtWRKY22[21]、AtWRKY54和AtWRKY70[22]等。陈晓丽等[16]研究发现，橡胶树HbWRKY75基因的表达随着叶片的衰老显著升高，衰老晚期叶片中HbWRKY75的表达量最高，认为HbWRKY75可能是橡胶树叶片衰老过程的正调控因子。本研究中的组织表达谱分析表明，HbWRKY41在衰老叶片中的表达量最高，推测HbWRKY41可能参与了橡胶树叶片衰老调控。

天然橡胶是重要的工业原料和战略物资，其主要来源于巴西橡胶树。我国植胶业的持续健康发展才能保障天然橡胶的稳定自给。我国能植胶的区域有限，仅限海南、云南和广东部分地区，均属于非传统植胶区，巴西橡胶树种植过程中经常遭受干旱和低温等非生物逆境胁迫。解析巴西橡胶树非生物胁迫响应的分子机制将为其非生物胁迫抗性遗传改良奠定基础。越来越多的研究表明，当植物遭遇低温、干旱、高盐、高温或渗透胁迫时，WRKY转录因子通过转录调控参与了植物非生物胁迫应答信号转导过程，在各种胁迫诱导信号通路中扮演着重要角色[1，23]。迄今为止，在拟南芥、水稻、棉花、小麦、大豆、玉米、葡萄等许多植物中分离鉴定了调控非生物胁迫应答的WRKY基因[23-24]。近年来，在巴西橡胶树中也发现了一些受低温或干旱等非生物胁迫调控的WRKY基因，如HbWRKY1[25-26]、HbWRKY2、HbWRKY3、HbWRKY4[26]、HbWRKY9[14]、HbWRKY7和HbWRKY11[17]等。其中，HbWRKY1、HbWRKY2、HbWRKY3、HbWRKY4已被证实超量表达能提高转基因植株的抗旱/耐盐性[25-26]。本研究发现HbWRKY41的表达受低温、干旱和高盐胁迫诱导；在低温或高盐胁迫下，该基因表达量持续增加，处理48 h其表达量上调百倍以上，推测HbWRKY41可能在橡胶树非生物胁迫响应中起着重要调控作用。关于HbWRKY41在橡胶树非生物胁迫应答中的功能及其调控机制仍需要进一步的研究。

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CloningandExpressionAnalysisofaWRKYTranscriptionFactorGeneHbWRKY41inHeveabrasiliensis

LIU Hui，WEI Yongxuan，DENG Zhi，DAI Longjun，YANG Hong，LI Dejun

(Rubber Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree，Ministry of Agriculture，Danzhou 571737，China)

To reveal the molecular characterization and expression patterns of the WRKY transcription factor geneHbWRKY41 inHeveabrasiliensis(para rubber tree)，this gene was cloned from para rubber tree by RT-PCR.HbWRKY41 contained an open reading frame of 1 020 bp encoding a protein of 339 amino acids. The molecular weight and isoelectric point of HbWRKY41 were 38.48 kDa and 5.52，respectively. HbWRKY41 possessed a conserved WRKY domain and a C2HC-type zinc-finger motif，and it was clustered into the group Ⅲ of the WRKY family with WRKY41 proteins from castor，cotton，soybean andArabidopsisthaliana. Quantitative Real-time PCR analysis showed thatHbWRKY41 was expressed in root，bark，latex，leaf and flower of para rubber tree，with the highest expression in senescent leaf and relatively low expression in latex and bark.HbWRKY41 expression was up-regulated by cold，drought and salt stresses，its expression was continuously increased during cold or salt stress.HbWRKY41 may play important roles in regulating leaf senescence and abiotic stress responses in para rubber tree.

Heveabrasiliensis；WRKY transcription factor；Gene cloning；Expression analysis；Abiotic stress

2017-06-29

中国热带农业科学院基本科研业务费专项 (1630022017028；1630022014006)

刘 辉(1986-)，男，安徽亳州人，助理研究员，博士，主要从事植物分子生物学研究。

李德军(1975-)，男，辽宁朝阳人，研究员，博士，主要从事橡胶树分子生物学研究。

Q78；S794.03

A

1000-7091(2017)05-0091-06

10.7668/hbnxb.2017.05.014