紫苏PfDGAT2基因生物信息学及表达特性分析

梁 倩，李 璐，周雅莉，安 茜，王计平

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

紫苏PfDGAT2基因生物信息学及表达特性分析

梁 倩，李 璐，周雅莉，安 茜，王计平

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

为研究二酯酰甘油酰基转移酶2(PfDGAT2)在紫苏种子油脂合成过程中的调控作用，对紫苏DGAT2基因及其编码的蛋白质进行了详细的生物信息学分析，并研究了该基因在不同紫苏品种中的表达特性。结果表明，PfDGAT2基因cDNA全长1 249 bp，共编码329个氨基酸；DGAT2蛋白的等电点为9.46，属于碱性蛋白质；二级结构预测表明，紫苏DGAT2蛋白的主要结构元件是无规则卷曲(34.65%)和α-螺旋(30.09%)；系统进化树分析表明，紫苏与芝麻和烟草的亲缘关系较近，与油橄榄的亲缘关系较远。通过研究PfDGAT2基因在含油量不同的2个紫苏品种种子发育的不同时期表达特性，结果表明，该基因在开花后30 d形成的种子中表达量最高，但是二者又具有一定差异，晋紫苏1号(含油量46.88%)表达量为开花后10 d的1.63倍，并紫苏1号(含油量35.60%)为0.75倍，因此，推测DGAT2在紫苏TAG生物合成中起重要调控作用。

紫苏；二酯酰甘油酰基转移酶2(DGAT2)；生物信息学；表达特性分析

紫苏(Perillafrutescens)又名桂荏、白苏，系唇形科紫苏属一年生草本植物，是国家卫生部首批颁发的既是食品又是药品的中药植物之一[1-3]。在紫苏籽油中，α-亚麻酸含量高达62.73%，亚油酸为15.43%，油酸为12.01%，是目前所知α-亚麻酸含量最高的新型油料作物之一[4]。因此，紫苏植物油被认为是深海鱼油的良好替代品[5-7]。

植物油作为食用油，不饱和脂肪酸含量较高，可以降低人体血液中胆固醇含量，降低动脉硬化发生的概率[8]。植物油脂主要以三酰甘油(TAG)的形式贮藏在种子中，在TAG的合成积累过程中二酯酰甘油酰基转移酶基因(DGAT2)起重要调控作用。目前，在植物中已发现有3种不同类型的DGAT基因，分别为DGAT1、DGAT2和DGAT3，广泛存在于叶片、花瓣、果实、花粉囊以及发育的种子等不同器官中[9]，DGAT1在植物各器官中均有表达[10]，油桐DGAT2主要在种子发育时期高量表达[11]。DGAT2是生物体内一种非常重要的酶，它被认为是控制高甘油三酯(TAG)所致疾病，如肥胖症、高血糖、糖尿病、脂肪肝等的潜在标靶[12]。

本研究较为详细地分析了紫苏PfDGAT2基因编码的蛋白结构及该基因的表达特性，旨在为深入研究该基因的生物学功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1植物材料

从晋苏1号紫苏根、茎、叶、花及种子混合样品转录组测序数据中挑选出功能注释为DGAT2的基因，根据不同物种间同源基因的核酸序列相对保守的特点，将紫苏中该基因序列与拟南芥DGAT2同源序列进行比对分析，最后得到紫苏DGAT2基因全长cDNA序列。

选取含油量不同的2个紫苏品种(中北大学张志军老师提供)：晋紫苏1号(含油量46.88%)和并紫苏1号(含油量35.60%)，对发育不同时期的种子(开花后10，20，30，40 d)PfDGAT2基因表达特性进行分析，研究该基因表达对紫苏种子含油量的影响。

1.2试验方法

1.2.1 紫苏DGAT2基因序列及蛋白功能分析 通过在线分析软件ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)对紫苏DGAT2基因编码蛋白进行理化性质分析；利用TMHMM-2.0(http：// www.cbs.dtu.dk/ servi ces/ TMHMM-2.0/)软件和SignalP 4.1(http：// www. cbs. dtu. dk/services/ SignalP/)对紫苏DGAT2的跨膜域、信号肽进行分析；采用在线软件SOPMA对紫苏DGAT2二级结构进行预测；采用在线分析软件Swiss-Model(http：//www.swissmodel.expasy.org/)进行紫苏DGAT2三级结构分析及建模。运用MEGA 6.0多序列比对软件对紫苏及其近缘种的DGAT2蛋白进行比对，并构建系统进化树。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测 根据紫苏DGAT2基因的cDNA序列设计荧光定量PCR特异引物，cDNA第1链合成采用TaKaRa公司试剂盒，实时荧光定量采用康润公司GenStar试剂盒。以紫苏18SrRNA作为内参基因[13]，进行荧光定量PCR检测。反应体系(10 μL)：2×RealStar Green Power Mixture 5 μL，RNase-free H2O 4.2 μL，上下游引物各0.2 μL，ROX Reference Dye(50×)0.2 μL，模板cDNA 0.2 μL；采用2步法Real-time PCR，反应过程为：95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，57 ℃ 1 min，40个循环。

2 结果与分析

2.1PfDGAT2基因全长cDNA序列及编码蛋白的生物信息学分析

紫苏DGAT2基因全长cDNA序列1 249 bp，开放阅读框(ORF)为990 bp,起始密码子ATG位于167 bp处，终止密码子TAA位于1 156 bp处，共编码329个氨基酸残基(图1)，其中，亮氨酸含量最多(10%)，谷氨酰胺含量最少(0.9%)；原子总数5 293，相对分子量为37.017 7 kDa；预测紫苏DGAT2蛋白等电点为9.46，不稳定系数为41.59，脂溶系数为100.09，总平均亲水系数为0.272，因此，推测其为亲水性脂溶蛋白。

图1 PfDGAT2基因的全长序列以及编码的氨基酸序列Fig.1 Full-length cDNA of PfDGAT2 gene and amino acid sequences translated

紫苏DGAT2蛋白的跨膜结构显示(图2)，DGAT2蛋白在29-51位、53-75位氨基酸之间形成了2个典型的跨膜螺旋区，表明PfDGAT2蛋白可能是一个与细胞信号转导有关的膜受体蛋白。

使用SignalP 4.1对紫苏DGAT2蛋白进行信号肽及切割位点预测(图3)，结果显示，该蛋白没有信号肽。

图2 PfDGAT2蛋白跨膜区结构预测结果Fig.2 The prediction of transmembrane domain for DGAT2 protein in Perilla frutescens

图3 PfDGAT2蛋白信号肽预测结果Fig.3 Predicted signal peptide of DGAT2 protein in Perilla frutescens

运用SOPMA对紫苏DGAT2蛋白进行二级结构预测，结果显示，该蛋白的二级结构主要由4种结构元件组成：无规则卷曲(34.65%)、α-螺旋(30.09%)、延伸链(23.71%)、β-转角(11.55%)。利用SWISS-MODEL在线软件对该蛋白三级结构进行预测结果如图4所示。

使用MEGA 6.0多序列比对软件对紫苏(Perillafrutescens)及其芝麻(Sesamumindicum)、油橄榄(Oleaeuropaea)、向日葵(Helianthusannuus)、烟草(Nicotianatabacum)等DGAT2基因编码蛋白序列进行比对分析并构建进化树，分析结果显示，紫苏与芝麻、烟草亲缘关系较近，与油橄榄亲缘关系较远(图5)。

图4 PfDGAT2蛋白质三级结构预测Fig. 4 The tertiary structure prediction of DGAT2 protein in Perilla frutescens

图5 PfDGAT2与不同物种DGAT2蛋白的系统进化树分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of PfDGAT2 and DGAT2 protein in different species

2.2PfDGAT2基因表达特性分析

为了进一步了解DGAT2基因在紫苏种子不同发育时期的表达特性与种子含油量的关系，本研究选取含油量不同的2个紫苏品种晋紫苏1号(含油量46.88%)和并紫苏1号(含油量35.60%)，对DGAT2基因在种子发育不同时期进行表达特性分析(图6)。荧光定量PCR分析结果显示，该基因在2个品种开花后10 d的表达量都比较高，然后降低，到开花后30 d表达量又达到高峰，分别以并紫苏1号、晋紫苏1号开花后10 d作为对照，并紫苏1号开花后30 d表达量为开花后10 d的0.75倍，而晋紫苏1号为1.63倍。

a、b表示在0.05水平方差分析差异显著性。 a and b indicates significant difference at 0.05 level.

3 结论与讨论

在植物中，三酰甘油(TAG)是油料作物种子中能量贮存的主要形式，其主要机制是使二酰甘油加上脂肪酸酰基辅酶A以共价键结合形成三酰甘油。DGAT2被认为是多种植物中调控种子油含量的关键酶，对于调节种子脂肪酸组成具有重要作用[14]。为进一步了解DGAT2基因在紫苏油脂合成过程中的功能，本研究对该基因进行了详细的生物信息学分析，结果表明，该基因cDNA全长序列为1 249 bp，共编码329个氨基酸残基，相对分子量为37.017 7 kDa，属于亲水性脂溶蛋白；跨膜结构预测DGAT2为膜受体蛋白；无规则卷曲和α-螺旋是二级结构中最主要的结构元件；对DGAT2蛋白进行系统进化树分析，紫苏与芝麻、烟草亲缘关系较近，与油橄榄亲缘关系较远。

TAG是大多数植物和动物体内最重要的油脂贮藏形式，DGAT是TAG合成反应的限速酶之一，对于种子油脂合成起重要调控作用[9]。DGAT2存在于动物、植物和酵母中，经试验证明，DGAT2在大豆等转基因油料作物中过量表达均能提高种子的含油量[15]。Shockey等[11]研究证明，DGAT2对种子三酰甘油的合成起着关键作用，虽然DGAT2与DGAT1都能催化二酰甘油结合CoA形成三酰甘油，在大多数高等植物的各组织器官中DGAT1基因均有表达，但DGAT2更侧重于特殊脂肪酸的积累，在一些含有稀有脂肪酸的植物中，DGAT2可能对于种子油脂积累具有更重要的作用[16-18]。Lardizabal等[14]将拉曼毛霉(Umbelopsisramanniana)DGAT2A(UrDGAT2A)在大豆中高量表达，结果使得种子含油量提高了1.5%。紫苏籽的油脂含油率达40%～50%[19-20]，并且主要以TAG形式存在，为了研究DGAT2基因在紫苏种子油脂积累过程中的作用，本研究对含油量不同的2个紫苏品种不同发育时期的种子进行表达特性分析，结果表明，DGAT2基因在晋紫苏1号、并紫苏1号2个品种种子发育不同时期中均有表达，在开花后30 d表达量达到最高，并且晋紫苏1号开花后30 d表达量为开花后10 d的1.63倍，高于并紫苏1号，表明DGAT2基因在紫苏种子TAG生物合成过程中起重要作用。

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BioinformaticsandExpressionAnalysisofPfDGAT2GeneinPerillafrutescens

LIANG Qian，LI Lu，ZHOU Yali，AN Xi，WANG Jiping

(College of Agronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China)

In order to study the regulatory role of Diacylgycerol Acyltransferase 2 (PfDGAT2) in the process of oil and lipid synthesis ofPerillafrutescensseeds, the structure and functions of the protein were analyzed by bioinformatics methods, and the gene expression characteristics were studied in differentPerillafrutescensvarieties. The results showed thatPfDGAT2 gene full-length cDNA was 1 249 bp，encoding 329 amino acid.PfDGAT2 protein isoelectric point was 9.46，belonging to the basic protein. The secondary structure prediction showed that the main components of PfDGAT2 protein were random coil (34.65%) and alpha helix (30.09%). Phylogenetic tree analysis indicated thatPerillafrutescenshad closer genetic relationship withSesamumindicumandNicotianatabacum，and had farther relationship withOleaeuropaea. By studying the expression characteristics ofPfDGAT2 gene in two differentPerillafrutescensvarieties, the relationship betweenPfDGAT2 gene expression and oil content was analyzed. The results showed that the expression level of the gene was the highest at 30 days after flowering, but there was a certain difference between two varieties. The expression level of Jinzisu 1 (oil content 46.88%) was 1.63 times of that of 10 days after flowering, but Bingzisu 1 (oil content 35.60%) was 0.75 times.It suggested thatDGAT2 gene played a major regulatory role in TAG biosynthesis ofPerillafrutescens.

Perillafrutescens；Diacylgycerol acyltransferase 2(DGAT2)；Bioinformatics；Expression analysis

2017-08-26

国家自然科学基金项目(31201266)；山西省晋中市科技重点研发计划(农业)项目(Y172007-5)

梁 倩(1990-)，女，山西临汾人，在读硕士，主要从事紫苏脂肪酸代谢机理研究。

王计平(1974-)，女，山西阳泉人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事植物油脂代谢机理研究。

S565.03；Q78

A

1000-7091(2017)05-0086-05

10.7668/hbnxb.2017.05.013