利用SNP芯片构建甘蓝型油菜高密度遗传连锁图谱及含油量性状QTL分析

俎 峰，赵凯琴，张云云，原小燕，田正书，贺 斌，奚俊玉，束正齐，符明联*

(1.云南省农业科学院经济作物研究所，云南 昆明 650225；2.临沧市农业技术推广站，云南 临沧 677000；3.玉龙县农业技术推广中心，云南 玉龙 674100)

【研究意义】油菜是中国最重要的食用油料作物，常年播种面积超过700万hm2，产量1600万t以上[1]，其产油量年均占国产食用油料作物产油量的50 %以上[2]。在中国日趋紧张的食用油料供给形势下大力发展油菜生产对保障我国食用油安全具有重要意义。《油菜良种科技创新规划(2016-2020)》指出：“当前中国油菜产业发展的趋势是大力提高单产、含油量和改良特殊脂肪酸品质”[3]。因此，提高油菜籽含油量是当前及今后一段时间内油菜新品种选育的重点。【前人研究进展】国内众多育种者通过种质创新，已获得了籽粒含油量在50 %以上，乃至超过60 %的高含油量种质材料[4-6]。如何高效的将这些高含油量种质材料便捷地应用到新品种选育中，是油菜育种者亟需解决的问题。前人研究表明，油菜籽粒含油量主要由母体效应、胚基因效应、花粉直感、细胞质效应及相应的基因与环境互作效应共同控制，符合加性-显性-上位遗传模型，并且以加性、显性遗传为主，具有较高的广义遗传力[7-10]，是典型的数量遗传性状，适合遗传连锁作图与QTL分析。目前，各国研究学者分别在甘蓝型油菜的 19条连锁群上鉴定了3到27个含油量的 QTLs[11-14]。Ecke等[11]在甘蓝型油菜 DH 群体的连锁群 A6、A10 和 C2 上检测到3个种子含油量相关的 QTLs，这3个位点的加性效应解释 51 %的表型变异。Qiu等[13]在甘蓝型油菜 TNDH 群体的连锁群 A1、A3、A4、A8、C2、C3 和 C7 上鉴定了 7 个与种子含油量有关的 QTLs，共解释了 55 %的表型变异，其中位于 A1、A8 和 C3 染色体上的 QTLs 与控制芥酸含量的 QTLs一致。Zhang等[14]揭示了在甘蓝型油菜 BC1F1群体的连锁群 A1，A8，A10 和 C3 上有 5 个与含油量有关的 QTLs。Chen等[15]在甘蓝型油菜DH群体的连锁群 LG1～8、LG10、LG12～14、LG16 和 LG18 上,在6个环境中鉴定了27个与种子含油量有关的 QTLs。但鲜有在云南生境下利用连锁作图群体开展含油量QTL研究的报道。【本研究切入点】利用云南省农科院经作所油菜中心自主种质创新获得的含油量超50 %的纯系种质材料G28及云南甘蓝型油菜品种花油8号衍生纯系H008为亲本构建F1DH群体，并以此为研究群体利用甘蓝型油菜60K SNP芯片分型技术构建高密度遗传连锁图谱，结合云南传统油菜高产区丽江与临沧试验点2016-2017年DH群体含油量分析数据进行含油量性状QTL分析。再结合甘蓝型油菜参考基因组序列信息，利用Blast分析技术将QTL扫描结果与前人含油量QTL定位区间开展比较分析。【拟解决的关键问题】探知G28高含油量性状遗传规律，定位含油量性状主效QTL位点，为今后进一步解析G28高含油量性状遗传机制及利用该种质材料开展分子标记辅助高含油量品种选育提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

高油种质G28为云南省农科院经济作物研究所油菜中心通过种质创新获得含油量稳定在50 %左右的纯系[6]，低油材料H008为云南甘蓝型油菜推广品种花油8号衍生纯系，含油量稳定在40 %左右。以G28为母本，H008为父本利用小孢子培养技术[16]创建了包含175份株系的F1DH群体。2016年10月，175份DH株系及亲本分别播种在临沧(云南省临沧市博尚镇勐准村，23°43′03″N，100°03′19″E，海拔1819.50 m)和玉龙(丽江市玉龙县黄山镇长水村，26°51′54″N，100°11′59″E，海拔2378.8 m)试验点，随机区组排列，2重复。五叶期每行10株定植，行间距30 cm，株间距20 cm，田间管理依据育种实践进行。花期自由授粉，开放结实。成熟期株系收获，悬挂于储藏室，自然风干30 d后，单株脱粒。

1.2 DNA提取与SNP芯片分析

DH群体及双亲材料在云南省农科院科研创新大楼实验室内发芽，子叶平展时单株取样。采用天根高效植物基因组DNA提取试剂盒(DP350)依据使用说明提取DH株系及双亲材料DNA。利用甘蓝型油菜60K SNP芯片(Illumina Infinium HD Assay)[17]对DH株系及双亲DNA进行基因分型，分型实验在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室开展。

1.3 油菜籽粒含油量近红外检测与数据分析

采用FOSS NIPSystem近红外快速品质分析仪(Type:461040；Model：5000；扫描波长：1100～2500 nm)对DH株系单株收获籽粒进行含油量分析。每株系/重复测量10个单株，计2重复20单株数据取均值为株系含油量，具体仪器操作参见张美华等报道[18]。采用Excel对群体含油量数据进行统计分析。

1.4 遗传连锁作图与QTL扫描

利用软件JoinMap4.0结合MSTMap[19]计算DH株系SNP位点遗传距离并绘制高密度遗传连锁图谱，具体数据筛选及参数设置参见Liu等[20]报道。

利用IciMapping4.1软件ICIM-ADD模型[21]对2016-2017年临沧与玉龙两点DH群体株系含油量数据进行含油量性状QTL位点扫描，参数设置为Missing Phenotype: Deletion，Step：1.00，LODThredhold: 2.50。

1.5 甘蓝型油菜参考基因组本地化数据库搭建与SNP芯片探针序列Blast分析

从甘蓝型油菜序列数据库(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/data/)下载甘蓝型油菜基因组“Darmor-bzh”序列到本地计算机，使用blast+2.7.1软件包搭建本地化甘蓝型油菜参考基因组数据库。提交SNP芯片探针序列到本地化数据库进行Blast分析，参数为Evalue: e-18，允许1个碱基错配。具体操作参见俎峰等报道[22]。

图1 临沧点DH群体含油量频率分布Fig.1 The frequency distribution of oil content of 175 DH lines in Lincang

2 结果与分析

2.1 亲本与DH群体含油量表型分布

175份DH株系含油量在玉龙与临沧点均呈现正态分布，表现出负向超亲分离，未有超过高含油量亲本G28的DH株系。其中丽江点，DH群体含油量连续分布区间为33.53 %～47.19 %，平均含油量41.47 %，其中最低含油量株系较低含油量亲本H008低6.75 %，而最高含油量株系较高含油量亲本低3.07 %；临沧点含油量连续分布区间为35.16 %～45.85 %，均值为42.27 %，其中最低含油量株系较低含油量亲本H008低4.77 %，而最高含油量株系较高含油量亲本低3.27 %，整体分布较玉龙点数据更为集中(图1～2，表1)。

2.2 遗传连锁图谱构建与含油量性状QTL扫描

甘蓝型油菜60 K SNP 芯片共计包含51 257个SNP探针位点，其中20 183个SNP位点在双亲G28与H008间表现出差异，数据分析评估后有7821个群体单一基因型SNP位点用于遗传连锁图谱构建。利用JoinMap4.0与MSTmap作图软件构建了19个连锁群总长3838.2 cM，包含7601个SNP位点的高密度遗传连锁图谱(图3，封三)。利用该遗传连锁图谱结合2016-2017年玉龙与临沧试验点DH群体含油量考种数据，使用QTL ICIMapping 4.1软件ICIM-ADD模型进行含油量性状QTL扫描分析。以LOD>2.5为阈值设置，共计检测到6个含油量性状QTL，分别可解释表型变异率6.29 %～10.36 %。其中玉龙点检测到4个QTL，分别位于A01，A10，C05与C08连锁群上，命名为qOCa01.1，qOCa10.1，qOCc05.1与qOCc08.1，这4个QTL累计可解释26.67 %的表型变异；临沧点检测到2个QTL，分别位于A10与C05连锁群上，命名为qOCa10.2与qOCc05.2，累计可解释18.56 %的表型变异。未检测到2个环境下共有的QTL(表2)。

图2 玉龙点DH群体含油量频率分布图Fig.2 The frequency distribution of oil content of 175 DH lines in Yulong

2.3 含油量性状主效QTL映射参考基因组

提交12个含油量QTL峰值区间左右两侧的SNP位点(表2)探针序列到本地化参考基因组数据库进行blast分析，所有SNP探针序列(50个碱基)均100 %定位到参考基因组位点中(表3)。由此可以将检测到的含油量QTLqOCa01.1，qOCa10.1，qOCc05.1，qOCc08.1，qOCa10.2与qOCc05.2分别映射到参考基因组chrA01:18199776～18537648，chrA10:12518784～12601669，chrC05:37145291～38565229，ChrC08:19676216～20089898，ChrA10:14708940～14783747与Chr05: 1042668～1070281 区间内。

表1 亲本及DH株系含油量性状表现

表2 含油量性状QTL及其遗传效应

表3 含油量QTL两侧SNP标记Blast结果

与Raboanatahiry等[23]绘制的含油量及相关性状QTL映射图谱比较分析发现，qOCa01.1位点与前人报道的qC18:2-A1-SO与qC16:0-A1-SO区间重叠；qOCa10.1位点与前人报道的qOC-A10-3-KN区间重叠；qOCa10.2位点与前人报道的qOC-A10-1-KN区间重叠；qOCc08.1位点与前人报道的qOC-C8-2-SG区间紧密相邻；而qOCc05.1与qOCc05.2位点则在前人研究中未有对应的重叠或紧密相邻的QTL，推测为新的与油菜籽含油量相关的QTL。

3 讨 论

3.1 油菜籽含油量性状具有较强的遗传与环境互作效应

前人研究表明油菜籽粒含油量性状作为数量性状具有很高的遗传力，同时也发现含油量性状易受环境影响[7-9]。Guo等利用含油量各异的品种/自交系开展9×9完全双列杂交，分析油菜种子含油量的遗传及基因与环境互作效应。GoCGm分析表明甘蓝型油菜籽粒含油量形状主要由遗传效应及基因与环境互作效应决定，两者可解释总表型变异的86.19 %，而这其中基因与环境互作效应在总遗传变异占比高达51.68 %。这预示着在高含油量育种中，基因型与环境互作效应不容忽视。这也部分解释了各国研究学者累计在甘蓝型油菜的19条连锁群上鉴定了近百个含油量及含油量相关性状的QTLs，却鲜有稳定一致性的QTLs报道[15, 24-27]。因此基于服务云南地区油菜含油量提升的目的，十分有必要自主开展遗传连锁作图与含油量QTL研究。同时，玉龙与临沧地区是云南油菜传统高产区，其中临沧市在2016年更是创造了“亩产、百亩连片、千亩连片”3项全国最高记录，1.2亩理论亩产高达456.47 kg[28]，选择这2个环境开展DH群体含油量性状数据调查与QTL分析，对于今后推动云南油菜产业朝向高产、高含油量发展具有具有一定意义。

3.2 含油量QTL位点比较分析

由于前人研究含油量所使用的群体、分子标记类型及种植环境各不同，这些检测到的含油量QTL位点之间一直难以直接开展比较分析[9,23,29-30]。近年来随着甘蓝型油菜参考基因组序列信息的公布与60K SNP芯片的广泛应用极大的推动了甘蓝型油菜遗传连锁图谱整合与含油量QTL比较分析研究。Raboanatahiry等通过Blast分析，映射9张已报到的甘蓝型油菜遗传连锁图谱上的含油量QTL位点与脂肪酸QTL到参考基因组“Darmor-bzh”上，共鉴定出335个值得关注的脂肪酸与含油量相关的QTLs，其中82个QTLs彼此间存在重叠[23]。将本研究检测到的6个含油量QTL利用同样的方法映射到参考基因组“Darmor-bzh”后，与前人研究进行比较分析，发现其中4个QTL在前人研究中均有对应的重叠或邻近的QTL报道。qOCc05.1与qOCc05.2则没有对应的重叠或邻近的QTL报道，推测qOCc05.1与qOCc05.2为新的含油量性状相关的QTL。

3.3 下一步需要开展的工作

QTL作图是利用分子标记，把控制数量性状的基因作为一个整体定位在染色体上，并估计其遗传效应，其结果可以帮助育种者获得目标性状的遗传信息，并借助与之连锁的标记在育种群体中选择有利的等位基因型，进而提高选育的准确性和预见性[31]。良好的QTL作图是基因精细定位、克隆以及有效开展分子育种的基础，其结果的准确度与精确度主要受到作图群体大小，标记数目及表型数据调查三方面的影响。本研究以175份DH株系为研究材料，最终利用7821个SNP位点构建遗传连锁图谱，并在两个环境下分别检测到4和2个含油量QTL，但未检出一致性的QTL。为检验这些QTL的稳定性与可重复性，在下一步研究中可考虑增加DH株系的数量及在玉龙与临沧环境下做多年试验，同时在DH株系田间收获时需要依据成熟度分批取样，获得准确的田间表型数据，进而提升QTL扫描的准确度与精度。这将有助于今后精细定位主效含油量QTL与分子标记辅助高含油量油菜育种。

4 结 论

利用适宜于云南地区生产的高、低含油量双亲材料构建F1DH群体，采用甘蓝型油菜60K SNP芯片，结合玉龙与临沧试验点2016-2017年DH群体含油量数据，共挖掘到6个含油量性状QTL，分别位于A01，A10，C05与C08连锁群上，命名为qOCa01.1，qOCa10.1，qOCc05.1，qOCc08.1，qOCa10.2与qOCc05.2。Blast分析技术将这6个QTL位点映射到参考基因组-“Darmor-bzh” chrA01:18199776～18537648，chrA10:12518784～12601669，chrC05:37145291～38565229，ChrC08:19676216～20089898，ChrA10:14708940～14783747与Chr05: 1042668～1070281区间内。与前人研究结果比较发现qOCc05.1与qOCc05.2没有对应的重叠或邻近的QTL报道，推测qOCc05.1与qOCc05.2为新的含油量性状相关的QTL。研究的定位结果可为下一步精细定位主效QTL与分子标记辅助高含油量油菜育种提供数据支持。