米曲霉菌株NJ132液态发酵产孢子条件初步筛选

游见明，吕开斌，曹新志

（四川理工学院生物工程系，四川自贡643000）

米曲霉菌株NJ132液态发酵产孢子条件初步筛选

游见明，吕开斌，曹新志

（四川理工学院生物工程系，四川自贡643000）

对影响米曲霉菌株NJ132分生孢子生成的因素进行了比较。结果表明，NJ132菌株液态发酵分生孢子产生的适宜条件为：马铃薯培养基添加10 mg/L混合无机盐作为培养基，用容积300 mL的三角瓶装瓶装培养基120 mL，摇床转速为100 r/min，在温度25℃下暗培养5 d，第6天转入20℃、光照/黑暗循环（4 h周期）条件下培养至第7天。

米曲霉；分生孢子；液态发酵；发酵条件

对传统的白酒生产工艺的改革中，节能、减排、提高原料淀粉的利用率、增加出酒率等，一直以来都是行业不懈追求的目标。如对发酵原料进行膨化预处理来提升淀粉类物质的糖化率，在某些酒类产品（如啤酒、酒精[1]）生产上，已获得进展，在白酒的生产上也在进行类似的研究[2]。在进行膨化操作过程中，将糖化菌孢子添加到原料中，通过膨化操作过程，使菌种孢子充分混于发酵原料内部，有利于糖化操作环节的进行，利于原料淀粉的降解。

本文基于该过程对糖化菌孢子的需求，以马铃薯培养基为基础，对As.oryzae菌株NJ132液态发酵产分生孢子的适宜条件进行选择，为开展大量获得菌株孢子的研究工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

以四川省自贡市光大街菜市场民间作坊制作的甜酒曲为原料分离获得的耐热糖化酶菌株，属米曲霉，菌株号NJ132，由四川理工学院发酵工程实验室保存。

1.1.2 基础培养基

PDA 培养基[3]。

1.1.3 仪器与试剂

THZ-100恒温摇瓶培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；LED双目显微镜：麦克奥迪仪器公司；JB5374-91电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SYQ-DSX-280B手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂产品；MT-250恒温培养箱：上海和羽良电子有限公司；血球计数板：玉环县五金光学仪器厂。

硫酸铁、氯化锌、氯化锰、硫酸镁：分析纯，成都市科龙化工试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 孢子计数

用血球计数板计数孢子悬液中的孢子数[4]。

1.2.2 孢子悬液制备

接种NJ132于PDA培养基上，于25℃培养7 d，待霉菌产生大量分生孢子后，在平板中加入10 mL 0.1%的tween-80溶液，用接种环刮取分生孢子，分离悬液，于10 000 r/min离心10 min，沉降物用5 mL无菌生理盐水充分振荡将孢子制成悬液，再稀释成1×107个/mL孢子悬液备后续试验接种用。

1.2.3 单因素试验[5-6]

影响NJ132产生孢子的因素包括培养基成分、pH值、培养温度、通气、光照等。

在300 mL的三角瓶中加入100 mL培养液，接种1 mL孢子悬浮液，进行以下单因素培养试验，培养时间为7 d，无光照，对产孢子情况进行观察计数。

1.2.3.1 培养基成分试验

在基础培养基中添加无机盐等培养基构成成分以观察培养基构成成分对孢子形成的影响情况。碳源选用葡萄糖，添加量为10 g/L；无机盐包括：FeSO4、MnCl2、ZnCl2、MgSO4，添加量为 10 mg/L。接种后于 25 ℃恒温条件下培养。

1.2.3.2 培养条件试验

pH值影响：前期培养试验表明，菌株培养较适宜的pH值在6.0在左右。本试验中，用1 mol/L HCl溶液调节基础培养基pH值为6.0，接种后于25℃条件下培养。

温度影响：基础培养基接种后，于25℃恒温条件下培养至5天后，改变培养温度为20℃。

通气供氧影响：基础培养基接种后，将摇床转速设定为80 r/min，于25℃条件下培养。

光照影响：基础培养基接种后，于25℃恒温培养，在培养的第6天开始，用3 W荧光灯20 cm进行光照处理，处理过程为光照/黑暗交替，变换频率为4 h，处理2天后结束培养，对培养物进行观察比较以明确光照是否对产孢有影响。

试验对照培养为：在300 mL的三角瓶中加入100 mL基础培养液，接种1 mL孢子悬浮液，于25℃暗培养7 d，对产孢子情况进行观察计数。

1.2.4 正交试验

在单因素试验基础上，选择与菌株产孢子的影响显著的光照、温度、无机盐、摇床转速4个因子，进行四因素三水平进行正交试验。见表1。

表1 NJ132产孢子正交试验Table 1 The orthogonal test of spore production of NJ132

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

以基础培养基为对照，就可能影响菌株分生孢子产生的各因素分别进行的对比试验情况如下。

2.1.1 培养基成分的影响

以基础培养基培养作为对照，对比添加各种无机盐对孢子生成的影响情况，借助DPS数据处理系统进行平均数student t检验，结果见表2。

表2 培养基成分对孢子产生的影响Table 2 Effects of medium composition on spore production

从添加的几种无机盐的结果可以看出，无机盐对菌株产孢子有显著影响，从平均数数据看，在基础培养基之上添加无机盐对孢子生成具有促进作用。进一步就个不同不同无机盐之间的影响情况进行分析，发现在这几种无机盐之间，MnCl2与ZnCl2之间存在显著差异（DPS统计软件分析，p=0.031 9），而其余的各种无机盐之间不存在差异。根据这种情况，试验中将多种无机盐等量混合后添加于基础培养基进行正交试验。

2.1.2 培养条件对孢子生成的影响

改变各种培养条件对菌株产孢子的影响情况见表3。

表3 培养条件对孢子产生的影响Table 3 Effects of culture conditions on the spore production

根据表中显示的结果可以看出，在所选择的几种可能对菌株产孢子有影响的因素中，pH值在所选的情况下，对孢子形成没有显著影响。温度条件和通气状况及光照因素的影响最为显著。

2.2 正交试验结果

单因素的试验结果表明，在NJ132菌株产孢子培养过程中，对产分生孢子具有显著影响的因素有无机盐添加、温度刺激、光照刺激、通气条件。

表4 正交试验结果Table 4 Results of orthogonal test

正交试验结果的极差分析显示，在对菌株产孢子具有影响的几个因素中，温度是最重要的，其次是添加无机盐，通气状况和光照影响依次为第三和第四影响因素。根据各因素的优选水平为初步确定的培养方案为：在培养周期的后阶段（5 d开始）将温度由原来的25℃降为20℃；在马铃薯培养基基础上，复合无机盐添加量为10 mg/L；通气量：容积为300 mL的三角瓶中加入100 mL培养液，摇床转速100 r/min；光照：在培养周期前5 d采取黑暗培养，后2 d采用间隔4 h的光照处理。

表5 极差分析Table 5 Range analysis

3 结论

糖化酶菌株NJ132在马铃薯液体培养基上产孢子的能力可以通过培养条件的控制得到提升。从本试验的情况看，在不考虑碳源、氮源的情况下，添加一定量的无机盐对孢子生成能力有提升。无机盐在菌株生长代谢过程中具有多方面的功能，如调节代谢、参与原生质结构、平衡渗透压等。试验中添加的无机盐可能是通过对菌株的生长代谢起到了促进作用来提升包子产生能力的。微生物的孢子生成是由于生长环境出现变化，在恶劣的环境下出现的保护性适应，在培养周期的前阶段，环境条件适合菌株生物量积累。到培养周期后阶段时，环境条件变化后，不再适合其进行营养生长而转入孢子生成，在这个阶段，人为改变一些环境因素，在这些刺激因素影响下，菌株产孢子的能力得以促进。试验中通过在培养后期降低培养温度、利用光线刺激等措施，能够实现菌株产孢子能力的有效提升。

4 讨论

影响微生物菌株产孢子能力的因素很多，这方面的文献较多[4-7]。本次试验设计较为粗略，在于对孢子培养条件进行初步探索，实验结果对该菌株孢子的培养调控因素具有方向性指示作用，进一步的试验将考虑以下因素：对于无机盐需要进行更多种类的选择；不同的无机盐种类之间可能存在的拮抗关系。在光照方面，需要将光照强度进行量化，同时还需考虑不同波长的光照可能带来不同的刺激效果；温度因素中，本次试验选择的不同水平间跨度较大。同时，温度变化的时间点控制上还有待更为准确的试验加以确认；至于溶氧控制方面，在培养周期不同阶段对溶氧量的控制，对孢子生成能力的影响情况都还需要进一步试验确认。本试验虽然只是实验室内的小规模试验，但对进一步深入研究和大规模发酵生产都具有一定的指导意义。

[1]李大和.试论四川小曲酒的工艺和风味特征[J].食品与发酵工业,1991(1):49-53

[2]郭景峰,孙跃飞,宇晓昱.利用膨化技术对米糠保鲜处理[J].饲料工业,2005(9):45-46

[3]J萨姆布鲁克D W拉塞尔.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社,2008

[4]黄秀梨.微生物学实验指导[M].北京:高等教育出版社,1996:1-7,35-38,114

[5]庄敬华,高增贵,刘限,等.不同发酵条件对木霉产孢类型的影响[J].中国生物防治,2005,21(1):37-40

[6]陈胜军,王艳丽,张震,等.稻粒黑粉菌冬孢子萌发影响因素及其产孢培养基的筛选[J].江农业学报,2011,23(3):572-576

[7]高克祥,项存梯,骆会欣,等.木霉菌株T88生物学特性的研究[J].东北林业大学学报,1995,23(2):33-39

[8]高克祥,刘晓光,陈晋江,等.木霉菌株T95生物学特性的研究[J].河北林果研究,1998,13(4):359-366

[9]吕红线.酿酒酵母子囊孢子形成条件的研究[J].山东轻工业学院学报,1999,13(2):57-60

[10]池玉杰,伊洪伟,吉海龙.长枝木霉菌株T05液态发酵产孢和菌丝生物量条件的筛选[J].东北林业大学学报,2016,44(1):110-113

Preliminary Screening of the Fermentation Conditions of Spore Producing by Liquid Fermentation of the As.oryzae NJ132

YOU Jian-ming，LÜ Kai-bin，CAO Xin-zhi
（College of Bio-engineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

The factors affecting the production of NJ132 from As.oryzae were compared.The results showed that the suitable conditions for the production of conidia by liquid fermentation of NJ132 strain were：the potato medium was added with 10 mg/L mixed inorganic salt and 120 mL of the culture medium into triangular bottle，the rotate speed was 100 r/min，at a temperature of 25℃for 5 days in the dark；from the 6th day to the 7th，cultivating under the condition of light/dark cycle of cultivation（cycling per 4 hours）at 20 ℃.

As.oryzae；conidia；liquid fermentation；fermentation condition

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.035

酿酒生物技术及应用四川省重点实验室资助项目（NJ2013-13）

游见明（1966—），男（汉），教授，硕士，从事生物技术教学、科研工作。

2017-01-13