高速逆流色谱分离铁皮石斛中芥子酸的研究

张英洁，王晓，郑秀花，于金倩，刘峰，*

（1.山东师范大学生命科学学院，山东济南250014；2.山东省分析测试中心山东省中药质量控制技术重点实验室，山东济南250014）

高速逆流色谱分离铁皮石斛中芥子酸的研究

张英洁1，2，王晓1，郑秀花1，于金倩1，刘峰1，*

（1.山东师范大学生命科学学院，山东济南250014；2.山东省分析测试中心山东省中药质量控制技术重点实验室，山东济南250014）

运用高速逆流色谱技术从铁皮石斛中分离制备出芥子酸，为石斛属内首次分离得到。分离采用的溶剂体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（4∶6∶3∶7，体积比），上相做固定相，下相做流动相，流速2 mL/min，转速800 r/min，检测波长280 nm。单次进样石斛提取物200 mg，分离出纯度为93.11%的芥子酸20.34 mg，固定相保留率46.67%。体外抗氧化结果显示，芥子酸有较强的DPPH自由基清除能力，IC50为0.046 mg/mL。

铁皮石斛；高速逆流色谱；芥子酸；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼

铁皮石斛（Derdrobium officinale Kimura et Migo），兰科（Orchidaceae），石斛属，多年生附生草本植物，表皮为铁绿色，故称为铁皮石斛[1]。铁皮石斛是一味宝贵的中草药，《道藏》中将其列为“九大仙草”之首[2]，在民间被称为“救命仙草”。铁皮石斛性味甘，微寒；归胃、肾经；具有益胃生津、润肺止咳、滋阴清热的功效[3]。铁皮石斛的鲜茎可以直接食用，用于炖汤、泡茶、浸酒[4]等，通常加工成干品，如铁皮枫斗、铁皮石斛功能性饮料[5]等。因此铁皮石斛具有宝贵的医学价值，研究前景尤其乐观，具有很好的疗效以及保健功能。新的药理研究表明，铁皮石斛可用于治疗慢性萎缩性胃炎、高血压、糖尿病等疾病，具有抗肿瘤、抗衰老和增强免疫力的作用[6]。目前，国内外对于运用高速逆流色谱技术对铁皮石斛进行系统分离这一部分还是空白，所以快速建立铁皮石斛小分子化合物的系统分离技术至关重要，具有很好的创新性和可行性。

高速逆流色谱（High-Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC）运用了一种特殊的流体动力学现象[7]，不需要固态支撑体或载体的液液分配色谱，是一种能实现连续有效的分配功能的实用新型分离技术，广泛应用于各种天然产物的分离纯化，例如采用溶剂系统石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5∶5∶4.8∶5，体积比）分离纯化九里香中的黄酮类化合物[8]；溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（9∶1∶5∶5，体积比）分离制备出山芝麻中的三萜类成分[9]；连续运用正丁醇-乙酸乙酯-0.5%乙酸（3∶1∶4，体积比）和0.2%三氟乙酸-正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈（6∶5∶2∶1，体积比）的溶剂体系分离得到紫甘薯的花色苷单体[10]等。本研究首次应用HSCCC技术从铁皮石斛制备出芥子酸，并对其DPPH自由基消除能力进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铁皮石斛由大连普瑞康生物技术有限公司提供；制备及分离用溶剂均为分析纯；石油醚（90℃～120℃）、乙酸乙酯和正丁醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；乙腈为色谱纯：美国天地公司；DPPH：日本Wako公司；实验用水均为去离子水。

1.2 仪器与设备

HH-S4数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；SB-5200D超声波清洗机：宁新芝生物科技股份有限公司；TH-Ⅱ型薄层加热器：上海科哲生化科技有限公司；8823B型紫外检测仪：北京宾达英创科技有限公司；Agilent 1120高效液相色谱仪、1100 Series 6320 iontrap电喷雾离子阱质谱仪：美国Agilent公司；Varian INOVA-600核磁共振波谱仪：美国Varian公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的预处理

准确称取铁皮石斛粉末50 g置于1 000 mL圆底烧瓶中，加入500 mL工业乙醇（1∶10，体积比），水浴锅100℃沸水浴加热回流2 h，待冷却至室温后，抽滤，收集滤液，滤渣重提两次，合并3次滤液，减压浓缩至500 mL，用乙酸乙酯萃取，放掉下层水相，收集上层乙酸乙酯相，重复操作，直至上层乙酸乙酯相无色为止，将萃取液合并后减压浓缩至干，得到铁皮石斛的粗提物。

1.3.2 HSCCC溶剂体系的选择

通过试验分析比较不同比例高速逆流色谱的分配系数，确定高速逆流色谱最佳的溶剂体系是石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（4∶6∶3∶7，体积比），准确量取石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水，按比例置于分液漏斗中，充分振荡混匀后静置分层，分别收集上下相，上层做固定相，下层做流动相，超声脱气10 min，备用。

1.3.3 HSCCC的分离过程

将上层固定相以12 mL/min的流速注满高速逆流色谱仪的螺旋管，转速为800 r/min，待其注满后，下层流动相以2 mL/min流速泵入，开启检测器和记录仪，检测波长为280 nm，当主机出口流出流动相时，且螺旋柱内固定相和流动相达到动力学平衡状态固定相和流动相平衡后，将溶于固定相和流动相同比例的混合液中的样品注入进样圈，同时根据色谱图收集各色谱峰组分，并取各组分做HPLC分析。

1.3.4 HPLC分析及结构鉴定

铁皮石斛高速逆流色谱分离各组分通过高效液相色谱法分析。HPLC检测条件：色谱柱YMC-PackODSA-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），检测器 UV 280 nm，流动相乙腈-0.2%甲酸水，流速1 mL/min，进量20 μL。HSCCC各峰组分的结构根据ESI-MS-MS，NMR数据进行鉴定。

1.3.5 DPPH·的清除作用

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法常用于评价化合物或植物提取物的抗氧化活性[11]。DPPH·溶于乙醇溶液呈紫色，是一种稳定的自由基，在517 nm处具有最大吸收峰[12]，当DPPH溶液中加入自由基清除剂后，溶液颜色会变浅，517 nm处的吸光值变小，通过加入不同浓度的分离物反应后测定吸光度值的变化情况，得出试验数据，判断自由基的清除情况，进而对其抗氧化能力作出评价[13]。DPPH自由基清除计算公式为：

DPPH 自由基清除率/%=（A对照－A样品）/A对照×100

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛粗提物初步分离

准确称取10 g铁皮石斛粗提物和5 g硅胶（100目～200目），拌样，再准确称取 50 g硅胶（200目～300目）倒入石油醚∶乙酸乙酯=4∶1（体积比）的溶剂中，搅拌均匀后倒入分离柱，待柱面水平后静置平衡8 h，然后加入用硅胶（100目～200目）拌好的粗样，按梯度采用不同比例配制的石油醚∶乙酸乙酯（体积比）=4∶1，3 ∶1，2∶1，1∶1 的溶剂分别进行洗脱，收集洗脱液，硅胶层析检测。根据硅胶层析结果，收集石油醚∶乙酸乙酯（体积比）=3∶1的洗脱部分，减压浓缩至干，留用。

2.2 HSCCC分离条件优化

中分配系数的测定方法，从溶剂系统中上下相各取等量置于试管中，加入适量铁皮石斛粗提物样品，振荡混匀，静置分层后，在硅胶薄层板点等量样品，用石油醚-乙酸乙酯（3∶2，体积比）的展开剂展开，观察样品中各组分的相对含量以及在两相溶剂中的分配情况，计算K值。分配系数K=Cs/Cm，式中：Cs指溶质在固定相中浓度；Cm指溶质在流动相中浓度。

通过试验计算不同高速逆流色谱的K值，见表1，分析比较选择出最佳溶剂体系。

表1 不同比例溶剂系统的分配系数Table 1 Partition coefficient（K）of compounds in different solvent systems

由表1可得，溶剂系统乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水（4∶1∶0.2∶5，体积比）分配系数过大，分离需要耗费很长时间才能把化合物洗脱出来，洗脱效果很不理想，如图1（A）所示，改用尝试溶剂系统石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（4∶6∶3.5∶6.5，体积比），初步达到分离效果如图1（B）所示，改良方法，稍微降低甲醇含量，采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（4∶6∶3∶7，体积比）的溶剂系统，分配系数大小适合分离，保留率较高，分离效果最佳，见图1（C），故可以确定选择石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（4∶6∶3∶7，体积比）作为HSCCC的溶剂系统。以上相做固定相，流速2 mL/min，转速800 r/min，检测波长为280 nm，上相保留率为46.67%。单次进样200 mg，可分离出纯度为93.11%的芥子酸20.34 mg。

图1 铁皮石斛高速逆流色谱分离图Fig.1 High-speed countercurrent chromatography（HSCCC）separation of extract from Derdrobium officinale

2.3 HPLC分析

试验中分别考察了甲醇-水，乙腈-水和乙腈-0.2%甲酸溶液等作为HPLC流动相时，铁皮石斛中各组分的分离效果见图2。

图2 高速逆流色谱分离化合物液相分析图Fig.2 The HPLC analysis diagram of HSCCC

结果表明：当采用乙腈-0.2%甲酸溶液进行梯度洗脱时，流动相的流速为1 mL/min，在280 nm下检测可以得到良好的分离效果，纯度为93.11%。

2.4 结构鉴定

ESI-MS-MS：测定分子量为224，淡黄色粉末，熔点181℃～183℃。UV λ max（MeOH）：283 nm。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.511（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），6.978（2H，s，H-2，6），6.436（1H，d，J=16.0 Hz，H-8），3.801（6H，s，3，5-OMe）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：168.54（C-9），148.50（C-3，5），145.11（C-7），138.48（C-4），125.12（C-1），116.73（C-8），106.46（C-2，6），56.54（3，5-OMe）。根据以上数据，参照文献中芥子酸[12]的相关数据，与其符合，得以确定该化合物为芥子酸。

2.5 对DPPH·的清除作用

对DPPH·的清除作用见图3。

图3 对DPPH·的清除作用Fig.3 Scavenging effects of sinapic acid on DPPH assay

由图3可以看出，芥子酸对DPPH·有较好的清除作用，在浓度为0.01 mg/mL～0.2 mg/mL的时候，清除率随着浓度的增加而增加，芥子酸浓度在0.2 mg/mL时，对DPPH·的清除率高达88.51%。经计算得芥子酸清除 DPPH·的IC50为 0.046 mg/mL，而 VC的 IC50为0.002 6 mg/mL，芥子酸对DPPH·的清除率相对于VC较低。

3 结论

本试验通过优化条件运用高速逆流色谱技术分离制备出铁皮石斛中的芥子酸，采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（4∶6∶3∶7，体积比）的溶剂体系为，上相做固定相，流速为2 mL/min，转速为800 r/min，检测波长为280 nm，保留率为46.67%。单次进样量200 mg，分离出芥子酸20.34 mg，纯度为93.11%。通过试验测定芥子酸对DPPH自由基有较好的的清除作用，IC50为0.046 mg/mL，可以为将来天然氧化剂[15]的开发提供参考依据。

参考文献：

[1]聂少平,蔡海兰.铁皮石斛活性成分及其功能研究进展[J].食品科学,2012,33(23):356-361

[2]周桂芬,吕圭源.铁皮石斛不同部位黄酮碳苷类成分及清除DPPH自由基能力比较[J].中国中药杂志,2012,37(11):1536-1540

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2015:282-283

[4]王伟英,邹晖,陈永快.铁皮石斛的综合利用与展望[J].中国园艺文摘,2011(1):189-192

[5]杨兵勋,沈春香,王增,等.HPLC法测定铁皮石斛饮料中D-甘露糖的含量[J].食品科学,2011,32(8):275-277

[6]屠国昌.铁皮石斛的化学成分、药理作用和临床应用[J].海峡药学,2010,22(2):70-71

[7]张天佑,王晓.高速逆流色谱分离技术[M].北京:化学工业出版社,2011

[8]彭爱一,曲学伟,李慧,等.高速逆流色谱分离纯化九里香中的黄酮类化合物[J].色谱,2010,28(4):383-387

[9]苏丹,高玉桥,梁耀光,等.高速逆流色谱法分离制备山芝麻中的三萜类成分[J].中药材,2016,39(5):1053-1055

[10]陆英,李佳银,罗晋,等.高速逆流色谱制备分离紫甘薯花色苷[J].分析化学,2011,39(6):851-856

[11]韦献雅,殷丽琴,钟成,等.DPPH法评价抗氧化活性研究进展[J].食品科学,2014,35(9):317-321

[12]卢怡雯,李晓芬,项朋志,等.没食子酸清除DPPH自由基的紫外-可见吸收光谱研究[J].食品工业科技,2014,35(2):124-130

[13]成兰英,梁书凤,张治强.DPPH法研究麦冬提取物抗氧化活性[J].精细化工,2012,29(9):871-874

[14]吴增宝,常敏,李梦良,等.唐古特白刺果实化学成分研究[J].时珍国医国药,2013,24(12):2850-2851

[15]马丛丛,许继取,韩领,等.芥子酸及其生物活性研究进展[J].中国油脂,2016,41(5):75-79

Study on Sinapic Acid from Derdrobium officinale by High-Speed Countercurrent Chromatography

ZHANG Ying-jie1，2，WANG Xiao1，ZHENG Xiu-hua1，YU Jin-qian1，LIU Feng1，*
（1.College of Life Science，Shandong Normal University，Jinan 250014，Shandong，China；2.Shandong Key Laboratory of Quality Control of Chinese Medicine，Shandong Analysis and Test Center，Jinan 250014，Shandong，China）

Sinapic acid was separated and purified from Derdrobium officinale by high-speed countercurrent chromatography，which was isolated for the first time from Dendrobium.Ether-ethyl acetate-methanol-water（4∶6∶3∶7，volume ratio）was used as the two-phase solvent system，in which the upper and lower phase were used as the stationary and mobile phase，respectively.The flow rate was set at 2 mL/min，and the revolution speed was 800 r/min.The detection wavelength was 280 nm and the retention of stationary phase was 46.67%.Finally，20.34 mg of sinapic acid with a purity of 93.11%was obtained in a one-step separation from 200 mg of crude extracts.The results showed that sinapic acid had a strong DPPH radical scavenging ability in vitro and the IC50was 0.046 mg/mL.

Derdrobium officinale；high-speed countercurrent chromatography；sinapic acid；1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.005

国家高技术研究发展计划（2014AA022201-05）；山东省自然科学基金（ZR2014YL005）

张英洁（1991—），女（汉），硕士研究生，研究方向：天然产物分离纯化。

*通信作者：刘峰（1981—），男，副研究员，博士，研究方向：天然产物研究与开发。

2017-02-21