川贝母组织培养的影响因素研究

王伟，张大燕，文欢，汪颀浩，彭成，高继海

【研究论著】

川贝母组织培养的影响因素研究

王伟，张大燕，文欢，汪颀浩，彭成，高继海

目的：以川贝母鳞茎外表基部为材料，研究激素、暗处理时间与低温处理温度对鳞茎诱导效果的影响，为川贝母组培技术应用研究提供参考。方法：通过采用组织培养的方法，比较无菌处理的外植体在不同培养方式中的生长情况，并简要分析川贝母组织培养的影响因素。结果：低温暗处理，GA3均有利于打破鳞茎休眠，加快分化速度，同时GA3有提高愈伤组织诱导率的效果；这批试验样本中，愈伤组织诱导率最高为80.2%，不定芽诱导率最高为79.3%。结论：诱导生成不定芽的最佳激素配比为6-BA 2 mg﹒L-1+ NAA 0.5 mg﹒L-1，诱导鳞茎生成愈伤组织的最佳激素配比为6-BA 1 mg﹒L-1+ NAA 2 mg﹒L-1+ GA3 1 mg﹒L-1；低温暗处理诱导鳞茎分化效果最佳的组合为4 ℃+5 d。

川贝母；鳞茎；组织培养；影响因素；应用

川贝母（Fritillaria cirrhosa）为百合科植物，在云南、四川等地有栽培。其鳞茎有清热润肺，化痰止咳，祛瘀解结、降压解痉等功效[1]。川贝母对于生长环境要求较高，野生植株相对较少，由于其药用价值极高，近年来遭到人们大量采挖，造成了野生资源的极其匮乏。现在部分地区开始采用人工种植的方式来解决此问题，然而其繁殖系数小、发育周期长、种植成本高等因素大大的降低了此方法的可行性[2]。

近年来，组织培养技术的成功应用有望解决贝母资源匮乏的问题。根据现有资料，外植体再生鳞茎最普遍的处理是将外植体接入培养基让其表面直接长出小鳞茎或小芽，在短时间内可以得到大量的鳞茎[3]。郭生桢等学者研究发现5种贝母的幼鳞片诱导率最高[4]。目前关于川贝母的组织培养研究尚未系统进行，因此，针对现有研究空白，本实验研究了关于川贝母组织培养的一些影响因素并做简要分析，为川贝母后续研究提供参考，以期进一步推动川贝母资源的开发利用。

1 材料、仪器、试剂

1.1 材料

样品采自甘孜州康定市，采集时间为出苗盛期，经成都中医药大学药学院裴瑾教授鉴定为川贝母（Fritillaria cirrhosa）。

1.2 仪器

HIRAYMA HVE-50灭菌器（华粤行仪器有限公司）、1300系列A2生物安全柜（赛默飞世尔科技公司）、JA2003B电子天平（上海越平科学仪器有限公司）、QHZ-98B全温度光照振荡培养箱（太仓市华美生化仪器厂）、智能人工气候箱RTOP-280B（浙江托普仪器有限公司）。

1.3 试剂

MS培养基（批号20160815001，杭州百思生物技术有限公司）、6-苄基腺嘌呤（批号20150611，国药集团化学试剂有限公司）、α-萘乙酸（批号20150617，国药集团化学试剂有限公司）、赤霉素（批号20150519，国药集团化学试剂有限公司）、蔗糖（CAS：57-50-1，成都市科龙化工试剂厂）、琼脂（CAS：9002-18-0，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），无水乙醇（CAS：64-17-5，成都科隆化学品有限公司）。

2 实验方法

2.1 无菌处理

自来水冲洗材料2小时，刷洗掉表面的土壤杂质。选取颜色、质地相对一致的鳞茎外表基部，然后切成约6 mm 厚的小块作为外植体。首先将材料在75%酒精中浸泡1 min，再转入0.1%氯化汞溶液中浸泡10 min，最后在无菌水中清洗2～3次后转入培养基中。

2.2 培养基制备

培养基配制为组织培养过程中非常重要的过程，根据现有报道分析，最适宜贝母生长的培养基为MS基本培养基，特别对于种胚成苗的高生长促进效果方面表现突出[5]，本文采用培养基为MS 4.74 g﹒L-1+蔗糖30 g﹒L-1+琼脂4 g﹒L-1+活性炭0.3 g﹒L-1+激素。培养基配制好后，分装至培养瓶内，121 ℃ 灭菌20分钟后放入超净工作台至凝固备用。

2.3 培养条件

温度、光照、湿度等为植物组织培养中的重要因素，其中温度和光照是这2种环境因子不仅影响细胞增殖和器官分化,而且对次生产物的形成有很大的影响[6]，考虑川贝母生长的特殊环境，本研究在李旦[7]等相关报道的基础上进行优化处理，光照强度2200 lx，光照16 h，暗培养8 h，散射光培养18 ℃ ± 1 ℃，湿度为49% RH。

2.4 激素的处理方式

2.4.1激素初始筛选 首先用6-BA（6-苄基腺嘌呤）、NAA（α-萘乙酸）组合方式进行筛选确定激素使用范围，每种激素选取相同的6种浓度，即0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L，每种组合做三次重复，培养观察，组合方式见表1。

表1 激素筛选方式

2.4.2激素正交设计 根据2.3.1的结果删除初始设计浓度3.0 mg﹒L-1，将GA3（赤霉素）、6-BA（6-苄基腺嘌呤）、NAA（α-萘乙酸）按照正交方法设计实验[8]，GA3的设计水平为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，具体信息见表2。

表2 激素正交设计方案

2.5 培养方式

以往报道提出低温和暗处里均可以打破贝母鳞茎休眠，加快分化速度，根据已有研究，本文选出2.3.1中愈伤组织诱导率及不定芽诱导率最高的两组激素组合进行不同的低温暗处理培养，处理方式见表3。

表3 低温暗处理方式

3 结果与分析

观察在不同的培养方式下组织的生长情况，不定芽与愈伤组织分别见图1-A、1-B。结果发现有GA3的对照组和经过低温暗处理的对照组分化速度明显快于只含NAA、6-BA的实验组，而且含GA3的培养基中愈伤组织诱导率明显提高。35天后（不包括低温暗处理时间）对川贝母生长情况进行统计，在不含在有GA3的培养基中，激素组合6-BA 2 mg﹒L-1+ NAA 0.5 mg﹒L-1能够很好诱导不定芽生长，激素组合6-BA 1 mg﹒L-1+ NAA 2 mg﹒L-1能够较好诱导愈伤组织的形成；添加GA3后，6-BA 2 mg﹒L-1+ NAA 0.5 mg·L-1+ GA3 0.5 mg·L-1 的培养基不定芽诱导率最高，其不定芽诱导率达到60.5%，但是低于此培养基不加GA3时的不定芽诱导率，推测GA3 有抑制不定芽发育的效果；诱导鳞茎生成愈伤组织的最佳激素配比为6-BA 1 mg﹒L-1+ NAA 2 mg﹒L-1+ GA3 1 mg﹒L-1；低温暗处理诱导效果最佳的组合为4 ℃+5 d。6-BA+NAA、6-BA + NAA + GA3、6-BA+ NAA+低温暗处理 这3种方式的最佳处理结果见表4。

图1 川贝母在不同环境的生长情况

表4 三种方式最佳处理结果

愈伤形成率（%）=（长有愈伤组织的外植体数 /全部的外植体数）×100%

不定芽形成率（%）＝（产生芽的外植体数 / 全部外植体数）×100%（同时形成不定芽和愈伤的材料也纳入统计）

4 讨论

4.1 激素的影响

植物组织培养与多种激素同时存在关系，本实验在研究不同因素对川贝母分化效果比较的过程中发现，GA3不仅可以打破鳞茎休眠，加快分化速度，还能诱导材料形成愈伤组织，这与樊军[9]、熊增芳[6]等的报道相似，由此推测GA3本身或者与其它激素结合使用时有提高愈伤组织诱导率的效果。诱导生成不定芽的最佳激素配比为6-BA 2 mg﹒L-1+ NAA 0.5 mg﹒L-1，6-BA与 NAA浓度比为4：1，沈海龙[10]指出当细胞分裂素与生长素比例较高时利于芽的分化的结论与本实验结果吻合。研究发现[11]，植物体内的细胞分裂素由5，-腺苷单磷酸（5，-AMP）与二甲基丙烯基（DMAPP）经过一系列酶催化反应得到，中间会产生核糖、磷酸基团等物质，同时伴随着一系列酶的失活与活化，这些物质都有可能引起组织体内基因的表达，如果使用不同浓度的激素时，产生的效果自然不同。关于生长素的研究报道甚少，不过已有研究证明生长素可以作用位于质膜上的H+-ATP酶（P型ATP酶），这个酶能通过酸化质外体来增加细胞壁的伸展。目前植物激素对于其生长的详细调控机制尚未研究清楚，例如细胞分裂素和生长激素一起使用可以促进细胞的分裂也会影响植物细胞的分化，同时激素之间的相互作用机制也非常复杂。但值得一提的是，通过不断的实验研究可以找到最佳的贝母组织培养方案，为后续研究提供参考。

4.2 低温黑暗的影响

大量研究表明，黑暗和光照条件下低温处理植物对其代谢机制有重大影响，植物激素及其它内源性物质在低温黑暗环境下所起的作用和含量都会发生变化。例如常见的生长抑制激素脱落酸，相关报道指出其代谢变化与低温信号存在密切联系[12]，此外，对于低温诱导组织萌发或开花有研究者认为是赤霉素参与了成层以及春化过程[11]，因为不经过冷处理而直接施加赤霉素也可以获得同样的效果，但是目前仍未搞清赤霉素介导了温度刺激的原因。李招弟在红花幼苗研究中发现，低温暗处理的幼苗的生理指标与对照组相比差异明显[13]，结果证明低温黑暗处理确实对植物自身调节的影响较大。因此，若在鳞茎培养初始阶段设置一个低温黑暗的信号，该信号通过影响植物代谢过程而改变某些物质的含量和活性，再加上合适的生长环境，鳞茎做出应答的速度和概率都会提高。这与贝母鳞茎长期生长在地表以下，几乎不见光照的生活环境也是密切相关的。

近年来，关于川贝母的组织培养研究尚未系统进行，例如内源与外源激素之间的联系、激素种类等方面的研究尚未进行，大多研究仅仅针对分化的某个环节，对于外植体的前期处理研究更是甚少。本研究将激素与低温黑暗处理等因素同时结合起来考虑有望成为川贝母组织培养的研究热点，一旦川贝母的组织培养技术能够全面应用，将会很大程度上推动农业经济以及医药行业的发展。

[1] 李 强. 组培川贝母(Fritillaria Cirrhosa D.Don)鳞茎形成和发育过程中的生理生化研究[D]. 四川大学, 2003.

[2] 高 燕, 贺宾, 范弢,等. 贝母愈伤组织的诱导及植株再生[J].新疆农业科学, 2005, 42(1)：35.

[3] 蔡朝晖, 李萍, 高山林. 中药贝母的组织培养研究概况[J]. 中草药, 1998, 29(4)：274.

[4] 郭生桢, 李惠芝, 潘景丽. 常用中药五种贝母的组织培养[J].特产研究, 1981,8(3)：20.

[5] 苏 新. 浙贝母种胚的离体培养[J]. 中药材, 1995,18(2)：62.

[6] 熊增芳. 暗紫贝母组织培养的研究[D]. 青海师范大学, 2009.

[7] 李旦, 谢忠利, 孙举聪,等. 川贝母组培快繁实用技术[J]. 中国农业文摘-农业工程, 2016,28(3)：63.

[8] 史周华,何雁. 中医药统计学[M]. 北京：中国中医药出版社, 2015.

[9] 樊 君, 朱四易, 李宝璋. GA对伊贝母休眠外植体诱导愈伤组织的作用[J]. 中药材, 1992,15(4)：6.

[10]沈海龙.植物组织培养[M].北京：中国林业出版社,2005.

[11] 布坎南. 植物生物化学与分子生物学[M]. 成都：科学出版社, 2004.

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[13] 李招弟, 马履一, 陈发菊. 黑暗和光照条件下低温胁迫对红花玉兰幼苗生理特性的影响[J]. 福建林业科技, 2009,36(2)： 242.

Study on the influencing factors of Chuanbeimu tissue culture/

WANG Wei, ZHANG Da-yan,WEN Huan, WANG Qihao, PENG Cheng, GAO Ji-hai//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: With Chuanbeimu bulb appearance base as the materials, the effects of hormone, dark processing and low temperature on the bulb was investigated to provide a reference for the tissue culture technology of Chuanbeimu. Method:Using tissue culture method, the growth conditions of explants in different culture medium were compared and the influence factors of Chuanbeimu tissue culture was analyzed. Result: Low temperature, dark environment and GA3 were conductive to break the dormancy of the bulb and accelerate the differentiation rate. GA3 also improved the frequency of callus induction. In these samples, the highest frequency of callus induction was 80.2%, and the highest rate of adventitious buds inductivity was 79.3%.Conclusion:The best hormone combination for inducing buds from bulb is 6-BA 2 mg﹒L-1+ NAA 0.5 mg﹒L-1. The best hormone combination for inducing callus formation from bulb is 6-BA 1 mg﹒L-1+ NAA 2 mg﹒L-1+ GA3 1 mg﹒L-1. The optimum combination of low temperature and dark environment for inducing bulb is 4 ℃ +5 d.

Chuanbeimu; bulb; tissue culture; in fl uence factor; application

R 282.2

A

1674-926X(2017)04-001-03

成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

王伟（1995-），男，在读学士，研究方向：生药学 Tel：18980924453 Email：1185213978@qq.com

高继海（1983-），男，博士，研究方向：分子生药学 Tel：13709094661 Email：271969318@qq.com

2017-03-17

（责任编辑： 胡慧玲）