注射用雷替曲塞对胃癌患者癌细胞的影响及作用机制研究

马世华， 施能胜

(1.江苏省南京市溧水区人民医院药剂科， 江苏 南京 211200 2. 南京医科大学附属江宁医院药学部， 江苏 南京 211100)

注射用雷替曲塞对胃癌患者癌细胞的影响及作用机制研究

马世华1， 施能胜1

(1.江苏省南京市溧水区人民医院药剂科， 江苏 南京2112002. 南京医科大学附属江宁医院药学部， 江苏 南京211100)

目的了解注射液雷替曲塞对胃癌患者癌细胞的影响及作用机制。方法将购入的84只裸鼠建立人胃癌细胞MGC-803皮下移植瘤模型，建模成功后随机分为3组，常规组给予腹腔注射生理盐水，雷替曲塞组给予腹腔注射雷替曲塞，5-Fu组给予腹腔注射5-Fu，详细观察对比干预后裸鼠体重、移植瘤体积、瘤重、抑瘤率、凋亡率及癌细胞的周期分布情况。结果常规组裸鼠体重、移植瘤体积、瘤重均高于雷替曲塞组与5-Fu组，差异有统计学意义(P<0.05)；雷替曲塞组裸鼠体重高于5-Fu组，差异无统计学意义(P>0.05)，雷替曲塞组移植瘤体积、瘤重低于5-Fu组，差异有统计学意义(P<0.05)；常规组裸鼠癌细胞S期分布高于雷替曲塞组与5-Fu组，差异有统计学意义(P<0.05)；雷替曲塞组与5-Fu组S期分布，差异无统计学意义(P>0.05)；雷替曲塞组与5-Fu组G0/G1，差异无统计学意义(P>0.05)；雷替曲塞组与5-Fu组G0/G1期分布低于常规组，差异有统计学意义(P<0.05)；三组G2/M期分布无明显差异，差异无统计学意义(P>0.05)；常规组癌细胞抑瘤率、凋亡率明显低于雷替曲塞组与5-Fu组，差异有统计学意义(P<0.05)；雷替曲塞组癌细胞抑瘤率、凋亡率显著高于5-Fu组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论胃癌患者给予雷替曲塞治疗与5-Fu抑瘤效果相似，可有效抑制人胃癌细胞MGC-803裸鼠移植瘤生长，并可诱导癌细胞凋亡。

雷替曲塞； 胃 癌； 5-Fu

胃癌是我国恶性肿瘤中发生率最高的，系源于上皮的恶性肿瘤，好发于中老年人群，且存在较高的死亡率，严重威胁患者身体健康[1,2]。氟尿嘧啶类药物是胃癌化疗的基本用药，针对晚期胃癌患者化疗是延长其存活时间、提高生活质量的重要手段[3,4]。5-氟尿嘧啶(fluorouracil,5-FU)为嘧啶类抗代谢药，可阻止脱氧尿嘧啶核苷酸转变成胸腺嘧啶核苷酸，干扰DNA的合成，导致细胞损伤和死亡，但临床用药后大多数患者存在严重毒副作用及耐药性[5,6]。本文通过建立人胃癌细胞MGC-803裸鼠皮下移植瘤模型，分别给予雷替曲塞、5-Fu、生理盐水药物干预，研究其作用机制，现将研究报道如下：

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物与细胞株实验前一周从上海加科生物科技有限公司购入84只BALB/c雄性裸鼠(实验动物质量合格证编号：0000013647)，鼠龄均为4周，体重在16～20g。确定无特定病原体级屏障系统分笼饲养进行实验。人胃癌细胞株MGC-803由中国科学院上海生命科学研究院提供。本研究经临床医学伦理委员会批准，并符合国家实验动物“保护规范”及实验动物管理条例。

1.1.2主要药品与试剂鼠抗人p53单克隆抗体(购自上海常斤生物科技有限公司)，兔抗人GAPDH多克隆抗体(购自北京华夏远洋科技有限公司)。注射用雷替曲塞(南京正大天晴制药有限公司生产，国药准字：H20090325)。5-Fu(5-氟尿嘧啶，购自西安海欣制药有限公司，国药准字：H20050511)。

1.2实验方法

1.2.1建立人胃癌细胞MGC-803裸鼠皮下移植瘤模型将人胃癌细胞MGC-803对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白自酶消化1min，制成1×107/mL浓度的单细胞悬液，在超净台内于裸鼠腋下皮下注射0.2mL单细胞悬液(含活细胞数2×106个)。术后裸鼠全部存活，无明显不适反应。1周后裸鼠出现直径>5mm的皮下结节。

1.2.2裸鼠分组及药物干预建模完成后，将裸鼠随机分为3组，各组裸鼠均采用剪耳法标记，每组28只。在癌细胞接种后第10天，给予常规组裸鼠腹腔注射生理盐水，给予雷替曲塞组裸鼠腹腔注射雷替曲塞(7.5mg/kg/d)，给予5-Fu组裸鼠腹腔注射5-Fu(12mg/kg/d)，3组患者每只腹腔注射量均为0.2mL，持续注射5d，停2d，再继续给药5d。用药结束后2d，给予裸鼠颈椎脱位方式处死，将肿瘤组织连同包膜完整剥出，详细观察瘤体大体形态，取部分用于流式细胞分析的瘤体浸泡于70%酒精溶液，部分用于RT-PCR及Westernblot检测的瘤体保存在零下80度的低温冰箱中。

1.3观察指标

1.3.1裸鼠观察对裸鼠的神经状态、饮食、大便等情况进行严密观察，并定期给裸鼠进行称重。

1.3.2人胃癌细胞MGC-803裸鼠皮下移植瘤生长观察用游标卡尺每隔3d对肿瘤长径(A)与垂直横径(B)进行测量，并按照公式V=AxB-/2计算肿瘤体积，并绘制肿瘤体积增长曲线。当取出肿瘤组织后，称取肿瘤组织质量，并计算抑瘤率，计算公式为(对照组瘤重一实验组瘤重)/对照组瘤重x100%=抑瘤率。

1.3.3裸鼠瘤细胞的细胞周期分布与凋亡观察将固定好的肿瘤组织剪碎、捻搓直至肿瘤组织搓完为止，过滤并去除混浊液的杂质，离心沉淀后弃掉上清。用70%乙醇固定细胞，并采用Rnase酶消化，加入1mL溴化丙啶(PI)后放置4℃的冰箱中避光染色30min，并过滤，制成单细胞悬液供上机检测。采用Muticy-c1eAV分析软件对DNA周期进行拟合分析，并计算出细胞周期分布的百分率及凋亡百分率。

2 结 果

2.1干预后裸鼠体重、移植瘤的体积、瘤重对比由表1、图1可见，常规组裸鼠体重、移植瘤体积、瘤重均高于雷替曲塞组与5-Fu组，差异有统计学意义(F=18.65,385.01,490.73，P<0.05)；而雷替曲塞组裸鼠体重高于5-Fu组，差异有统计学意义(t=1.200,P>0.05)，移植瘤体积、瘤重等情况雷替曲塞组低于5-Fu组，差异有统计学意义(t=6.413,7.382,P<0.05)。

表1 干预后裸鼠体重及移植瘤的体积、重量比较

图1 各组胃癌细胞裸鼠移植体积变化曲线

2.2胃癌MGC-803裸鼠移植瘤细胞在各组细胞周期分布的情况由表2可见，常规组裸鼠癌细胞S期分布高于雷替曲塞组与5-Fu组，差异有统计学意义(F=70.89，P<0.05)，而5-Fu与雷替曲塞组S期分布情况，差异无统计学意义(t=0.958，P>0.05)；雷替曲塞组与5-Fu组G0/G1，差异无统计学意义(t=0.110，P>0.05)，而两组G0/G1低于常规组，差异有统计学意义(F=66.62，P<0.05)；三组G2/M期分布比例，差异均无统计学意义(F=2.36，P>0.05)。

2.3胃癌MGC-803裸鼠移植瘤细胞在各组凋亡率及抑瘤率的情况成功构建裸鼠移植瘤模型后，未出现裸鼠接种部位感染，无意外死亡裸鼠。常规组癌细胞裸鼠凋亡率为(25.98±1.61)%，抑瘤率为0.00%；雷替曲塞裸鼠的癌细胞凋亡率为(36.12±2.13)%，抑瘤率为49.34%；5-Fu组塞裸鼠的癌细胞凋亡率为(33.85±1.97)%，抑瘤率为40.32%。常规组凋亡率抑瘤率明显低于雷替曲塞组与5-Fu组，差异有统计学意义(F=216.05，P<0.05)；而雷替曲塞组癌细胞凋亡率与抑瘤率明显高于5-Fu组，差异有统计学意义(t=4.140，P<0.05)。且在治疗过程中所有裸鼠精神状态良好，未出现严重不良反应的发生。

表2 胃癌MGC-803裸鼠移植癌细胞在

3 讨 论

细胞增殖不受控制是恶性肿瘤最重要的特征之一，而大多数患者发生恶性肿瘤与细胞周期调控功能紊乱有关[7]。细胞凋亡与坏死是维持机体功能和形态所必须的，细胞凋亡与坏死不同，凋亡为机体正常生理或病理状态下细胞发生的程序性的、自发的主动死亡过程[8]。组织内稳态机制最重要的机制之一为调控细胞凋亡，一旦发生调控功能失常，易导致各种病理情况发生，如癌变、抗药性[9,10]。细胞周期监控机制受到破坏是导致肿瘤细胞的无限增殖的主要原因，故临床恶性肿瘤的治疗主要为调控细胞凋亡[11]。大多数患者经氟尿嘧啶类药物(5-Fu、卡培他滨等)治疗后均会发生严重心脏毒性，而雷替曲塞作为一种胸苷酸合成酶的特异性抑制剂用于治疗后未有患者出现相关的心脏毒性，可用来代替氟尿嘧啶类药物[12]。雷替曲塞可抑制细胞DNA的合成与胸苷酸合成酶的活性，同时可潴留在细胞内长时间发挥抗肿瘤的作用，且治疗后不良反应轻，患者易于耐受[13]。

结合本文体外实验研究发现，雷替曲塞对人胃癌MGC-803细胞株抑制增殖及促进凋亡作用显著，可见雷替曲塞可通过诱导细胞凋亡而发挥抗胃癌的作用。根据干预后裸鼠体重、抑制瘤体积及瘤重等情况可了解，经腹部注射雷替曲塞与腹部注射5-Fu的裸鼠体重、抑制瘤体积及瘤重均显著低于经腹腔注射生理盐水裸鼠，表明经腹部注射雷替曲塞与腹部注射5-Fu干预后的裸鼠治疗可使瘤体变小，故裸鼠体重较轻。结合胃癌MGC-803裸鼠移植瘤细胞在各组细胞周期分布及凋亡率抑瘤率情况分析，腹部注射雷替曲塞裸鼠细胞凋亡率及抑瘤率均高于腹部注射5-Fu裸鼠，雷替曲塞可将人胃癌细胞胞株细胞S期的比例上升，从而将细胞进程阻滞在G0/G1期，表明雷替曲塞对胃癌细胞发生凋亡具有诱导作用，可抑制人胃癌细胞生长。

综合以上，胃癌患者给予雷替曲塞治疗可抑制癌细胞的增殖，可通过诱导细胞凋亡而发挥抗胃癌的作用。

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StudyontheEffectandMechanismofInjectionofRaltitrexedonCancerCellsinGastricCancerPatients

MAShihua,SHINengsheng,etal

(ThePeople'sHosptalinLishuiDistrictofNanjing,JiangsuNanjing211200,China)

Objective:To investigate the effect and mechanism of injection of raltitrexed on cancer cells in gastric cancer patients.Methods84 nude mice were purchased to establish the human gastric cancer cell MGC-803 subcutaneous tumormodel，after successful modeling ,micewere randomly divided into 3 groups, the conventional group

intraperitoneal injection of saline, the raltitrexed group were given intraperitoneal injection of raltitrexed, the 5-Fu group were given intraperitoneal injection of 5-Fu, nude miceweight, tumor volume, tumorweight ,inhibition rate,apoptosis rate, cycle distribution of cancer cellsafter intervention were observed.ResultsNude miceweight, tumor volume ,tumor weight of the conventional groupwere significantly higher than those of the raltitrexed group and the 5-Fu group, the difference had statistical significance (P<0.05);The raltitrexed group'snude mice weight was higher than that of the 5-Fu group, the difference had no statistical significance (P>0.05), tumor volume, tumor weight of the raltitrexed group were lower than those of the 5-Fu group, the difference had statistical significance(P<0.05);The nude mice cancer cells S phase distribution of the conventional group was significantly higher than that of the raltitrexed group and the 5-Fu group, the difference had statistical significance(P<0.05); The S phase distribution of the raltitrexed group and the 5-Fu group had no significant difference, the difference hadno statistical significance (P>0.05);There was no significant difference between the raltitrexedgroup and the 5-Fu group in G0/G1 , the difference hadno statistical significance (P>0.05);G0/G1 phase distribution of the raltitrexed group and the 5-Fu group was lower than that of the conventional group, the difference had statistical significance (P<0.05); G2/M phrase distribution among the three groups has no obvious difference, the difference hadno statistical significance(P>0.05);The conventional group's cancer cell inhibition rate, apoptosis rate were significantly lower than those of the raltitrexed group and the 5-Fu group, the difference had statistical significance(P<0.05); While those of the raltitrexed group were significantly higher than those of the 5-Fu group, the difference had statistical significance (P<0.05).ConclusionAdoptingraltitrexed for gastric cancer patients has similaranti-tumor effect with 5-Fu, which can effectively inhibit the growth of human gastric cancer cell MGC-803 xenograft tumor in nude mice and induce apoptosis of cancer cells.

Raltitrexed; Gastric cancer; 5-Fu

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.10.024

1006-6233(2017)10-1667-04

施能胜， 卞元清2