基质金属蛋白酶-9基因多态性与2型糖尿病视网膜病变的相关性研究

杨 洁， 马英慧， 董微丽， 崔秀成， 石 晶， 贾淑君

(承德医学院附属医院眼科, 河北 承德 067000)

基质金属蛋白酶-9基因多态性与2型糖尿病视网膜病变的相关性研究

杨 洁， 马英慧， 董微丽， 崔秀成， 石 晶， 贾淑君

(承德医学院附属医院眼科, 河北 承德067000)

目的研究基质金属蛋白酶9(MMP-9) -1562C/T基因多态性与中国北方汉族人群2型糖尿病视网膜病变的关系。方法采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)方法检测了180名健康对照者和400例2型糖尿病患者(其中单纯2型糖尿病患者180例、糖尿病视网膜病变患者220例)的MMP-9基因型,比较各组之间基因型及等位基因频率的差别。结果MMP-9-1562C/T正常对照组,糖尿病组,糖尿病视网膜病变组三组C、T等位基因频率分别为8.3%，91.7%；7.8%，92.2%；91.4%，8.6%，三组等位基因频率间差异有统计学意义(χ2=790.09，P=0.000)。三组C/C，C/T，T/T基因型频率分别为0%，16.7%，83.3%；2.2%，11.1%，86.7%；84.1%，14.5%，1.4%，三组基因型频率之间差异无统计学意义(χ2=470.16，P=0.000)，其中正常对照组与糖尿病视网膜病变组之间差异有统计学意义(P<0.01)；正常对照组与糖尿病组之间差异无统计学意义(P>0.01)；糖尿病组与糖尿病视网膜病变组之间差异无统计学意义(P<0.01)。与T等位基因型相比，C等位基因可能会增加2型糖尿病视网膜病变的发病风险。结论MMP-9基因-1562C/T多态性可能与2型糖尿病视网膜病变的发生有关,T等位基因可能是2型糖尿病视网膜病变的保护基因。

糖尿病视网膜病变； 基质金属蛋白酶-9； 基 因； 单核苷酸多态性

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是2型糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者中常见的并发症，是导致2型糖尿病患者视力丧失的最主要的原因，严重影响了糖尿病患者的生存质量，其发病机制至今尚未完全阐明[1]。糖尿病视网膜病变与多种危险因素密切相关，如年龄、高血压、性别等[2]，但不同地区、不同种族患病率存在差异[3]。提示基因在糖尿病视网膜病变的发生、发展中可能起着重要的作用。基质金属蛋白酶9(MMP-9)是基质金属蛋白酶家族(MMPs) 的一员, 主要参与血管基底膜主要结构成分，IV型胶原的降解,与糖尿病血管病变密切相关[4]。MMP-9基因启动子区-1562C/T,已经被证实是一种能影响其功能的突变[5]。本研究旨在探讨MMP-9基因-1562C/T多态性与2型糖尿病视网膜病变的关系。

1 资料与方法

1．1一般资料:本研究采用病例对照的研究方法。所有受试对象均为中国北方汉族人。病例来源：2014年5月至2015年8月我院内分泌科收治的2型糖尿病患者400例，均经1999年WHO 关于糖尿病的诊断标准[6]确诊，其中单纯2型糖尿病患者(DM组)180例，男91例，女89例；2型糖尿病视网膜病变患者(DR组)220例，男112例，女108例，所有2型糖尿病视网膜病变患者经过检查均不合并其他糖尿病并发症。正常对照组为性别、年龄、地区与病例组相匹配的180名健康者，男92例，女88例，来自我院体检中心。所有受检者均接受详细的眼科检查，包括：最佳矫正视力、眼压、裂隙灯显微镜、眼底照相等检查。眼底照相可疑DR的受试者行眼底血管造影检查以确诊DR。DR的诊断标准参照文献[7]。本研究经承德医学院附属医院伦理委员会批准，所有受试者均告知研究目的并签署知情同意书。

1.2检测方法

1.2.1记录所有受检人员的姓名、性别、年龄以及身高、体重、糖尿病病程、空腹血糖、体重指数、收缩压、舒张压等指标。

1.2.2受检者DNA的提取：抽取所有受检人员肘静脉血4mL，加EDTA抗凝，于-80℃保存，通过蛋白酶K消化-饱和氯化钠盐析法提取基因组DNA[8]。

1.2.3MMP-9基因-1562C/T多态性检测：应用PCR-RFLP技术。引物序列参考文献[2]设计,由上海生化生物工程公司合成,上游引物:5’-GCCTGGCACATAGATGGCCC-3’,下游引物:5’-CTTCCTAGCCAGCC-GGCATA-3’。PCR反应体系为20μL，包括灭菌去离子水10.4μL，DNA模板2.0μL，Taq DNA聚合酶0.4μL，10×PCR缓冲液2.4μL，PCR染料2.4μL，三磷酸脱氧核糖核酸(dNTPs)0.4μL和上下游引物各1.0μL。PCR循环条件：95℃预变性5min；以后按95℃变性20s，50℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环后，最后一步为72℃继续延伸7min。10μL酶切反应体系中加入8μL PCR产物后再加入10IU的限制性内切酶，置于37℃水浴过夜消化。消化后的产物置于经溴化乙锭染色的4%琼脂糖凝胶中电泳。

2 结 果

2.1三组研究对象基本资料分析：正常对照组、DM组、DR组三组之在年龄、体重指数、收缩压、舒张压等指标均无统计学差异(P>0.05)。但空腹血糖三组比较差异有统计学意义(P<0.05),病程DM组和DR组比较差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

表1 三组间临床资料对比

2.2MMP-9基因Hardy-Weinberg遗传平衡性检验三组中CC、CT、TT 基因型分布观测值与期望值之间差异无统计学意义(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg定律，说明能够达到遗传平衡，具有很好的群体代表性(见表2)。

表2 MMP-9基因型频率的Hardy-Weinberg 遗传平衡性检验

2．3MMP-9 C-1562T基因多态性和糖尿病视网膜病变的关系：( 见表3)。正常对照组, 糖尿病组, 糖尿病视网膜病变组三组C、T等位基因频率分别为8.3%，91.7%；7.8%，92.2%；91.4%，8.6%。三组C和T等位基因频率之间差异有统计学意义(χ2=790.09，P=0.000)。三组C/C，C/T，T/T 基因型频率分别为0%，16.7%，83.3%；2.2%，11.1%，86.7%；84.1%，14.5%，1.4%。三组之间差异有统计学意义(χ2=470.16，P=0.000)。卡方分割进行两两比较，认为P<0.01具有统计学意义。三组两两之间比较结果：正常对照组与糖尿病组之间差异无统计学意义(χ2=6.12，P=0.047>0.01)；糖尿病组与糖尿病视网膜病变组之间差异有统计学意义(χ2=322.56，P=0.000<0.01)；正常对照组与糖尿病视网膜病变组之间差异有统计学意义(χ2=325.55，P=0.000<0.01)。与C/T+T/T基因型比较，C/C基因型有可能增加2型糖尿病视网膜病变的发病风险。

2.4糖尿病视网膜病变相关危险因素分析：以有无糖尿病视网膜病变为因变量(有糖尿病视网膜病变=1，无糖尿病视网膜病变=0)，自变量为：病程、空腹血糖及MMP-9-1562C/T分别进行多因素logistic回归分析，结果显示病程、空腹血糖及MMP-9基因启动子区-1562C/C基因型是DR发生的危险因素(见表4)。

3 讨 论

糖尿病视网膜病变是2型糖尿病最常见且最严重的微血管并发症之一，对糖尿病患者的生活质量造成了极为严重的影响。随着全球糖尿病发病率的不断升高，2013年全球糖尿病患者已高达3.82 亿，估计到2035年将会高达5.92亿[9]；而在国内，2013年最数据显示我国糖尿病发病率为11.6%，18 岁以上糖尿病患者约有1.14亿[10]。近年来研究发现DR的发生与发展不仅与糖尿病的病程、血糖控制情况有关，还受一定的遗传因素[11]影响。目前认为DR的发病受多种基因的影响，其中每个基因都存在多态性现象。研究表明[12]多种基因多态性与DR有关，如一氧化氮合酶、血管内皮生长因子、糖基化终末产物受体、醛糖还原酶等基因多态性都与DR发生有关。

基质金属蛋白酶 9(MMP-9)又称IV型胶原酶, 在生理和病理条件下, MMP-9 可以降解许多细胞外基质(ECM)成分, 对细胞迁移, 组织重建, 血管新生起重要作用[13]。近年研究指出, MMP-9 在糖尿病视网膜病进展中, 参与组织的破坏, 是其进展的值得引起注意的危险因子[14]。这种MMP-9基因多态性参与糖尿病视网膜病变的发病机制目前尚不清楚。人类的MMP-9基因位于20号染色体长臂的11 区1带～13区1带之间(20q11.1～13.1)。MMP-9的表达主要是转录水平被调节，MMP-9基因启动子区含有许多顺式作用元件，这些顺式作用元件在其转录调节方面起非常重要的作用，其中就包括MMP-9基因启动子-1562区域C/T基因多态位点，它是一个很重要的调节元件，可能是一个转录抑制因子蛋白的结合位点，影响MMP-9基因的转录水平[15]。当MMP-9基因-1562位点C突变成基因T以后，DNA-蛋白质的相互作用被消除，由此产生高的启动子转录活性[16],导致MMP-9的表达增加，从而加速了Ⅳ型胶原的降解，减少了视网膜细胞外基质的堆积，阻止或延缓DR的发生与发展。相反，当T等位基因的频率减少时会加速DR的发生和进展。

本研究结果表明DR组的TT基因型频率和T等位基因低于正常对照组和DM组，T等位基因携带者DR的发病率明显降低，提示T等位基因可能是DR的保护性基因,这可能是由于携带T等位基因的MMP-9启动子的转录活性增强，导致MMP-9在组织中的表达增加[16],从而促进了细胞外基质的降解,抑制了DR的发生和发展。由此可见MMP-9-1562C/T多态性与DR的发生相关，突变型T等位基因可能是DR的保护基因。

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AStudyoftheAssociationbetweenPolymorphismsoftheMMP-9Geneandtype2DiabeticRetinopathy

YANGJie,MAYinghui,DONGWeili,etal

(TheAffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,HebeiChengde067000,China)

Objective:To study of the association between polymorphism of the MMP-9 gene(-1562C/T)and type 2 diabetic retinopathy.MethodsMMP-9 -1562C/T SNP was genotyped by polymerase chain reaction-restrictive fragment length polymorphism (PCR-RFLP) ,analysis in 180 healthy persons as control and 400 patients with type 2 diabetes including 180 complication-free cases and 220 with diabetic retinopathy (DR).ResultsAssociation between the MMP-9 -1562C/T SNP in promoter region and diabetic retinopathy: the C and T allele frequencies in Control, DM, DR groups are 8.3%，91.7%; 7.8%, 92.2%; 91.4%, 8.6% respectively. And the results have a significant deviation (χ2=790.09，P=0.000). The C/C, C/T , T/T genotypic frequencies of cases in the three groups are 0%，16.7%，83.3%；2.2%，11.1%，86.7%；84.1%，14.5%，1.4%.There's a significant deviation of C and T allele frequency of MMP-9 -1562C/T between the Control group、the DM group and DR group(χ2=470.16，P=0.000).There's a significant deviation of C/C,C/T,T/T genotypic frequencies between the Control group and DM group(P<0.01),or the DM group and DR group(P<0.01),while there is no significant deviation between the Control group and DM group(P>0.01) .Compared with the T allele, the C allele may increase the onset risk of diabetic retinopathy.ConclusionThe MMP-9 -1562C/T SNP may play a role in the genetic susceptibility to the invasion of diabetic retinopathy. T allele is a protective gene for diabetic retinopathy.

Diabetic retinopathy； Matrix metalloproteinase-9； Gene； Single nucleotide polymorphism

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.10.023

1006-6233(2017)10-1663-05

马英慧