咖啡对小鼠精子质量的急性影响

郭晓宁 王俊平 孙 燕 张玉婷 马 跃

咖啡对小鼠精子质量的急性影响

郭晓宁1王俊平2孙 燕2张玉婷1马 跃2

目的 探讨咖啡对小鼠精子质量的急性影响。方法 健康雄性昆明种小鼠40只，随机分为对照组和咖啡低、中、高剂量组，每天分别予10 ml/kg 0.9%氯化钠注射液、7.5 mg/kg、15 mg/kg和30 mg/kg咖啡灌胃；7 d后处死小鼠，检测各组小鼠的体重变化、脏器系数；显微镜下计数小鼠的精子数量、精子活动率、精子存活率、精子畸形率。结果 低、中、高剂量组小鼠体重、肝脏系数、睾丸系数、附睾系数、精子活动率、精子存活率、精子畸形率与对照组比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。但中、高剂量组小鼠的精子数量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 咖啡对小鼠存活、活性和形态无明显影响，但大量摄入可致小鼠精子数量减少。

咖啡；精子；脏器系数；精液质量；急性

随着我国生育政策的放开，人们生活水平的提高，优生优育越来越得到重视。饮食与人类健康息息相关，尤其对优生优育的影响引起人们的广泛关注。咖啡因其良好的口感和提神醒脑作用广为人们喜爱，是世界上广泛饮用的饮品之一，其主要成分是咖啡因，具有诸多对身体有益的生理功能，如提神醒脑、抗忧郁、控制体重、预防癌症等[1]，能刺激中枢神经系统、心脏和呼吸系统。但是，有关咖啡对生殖功能的影响尚未见报道。本试验以健康雄性昆明小鼠为研究对象，通过灌胃不同剂量的咖啡，观察小鼠体重变化，计算肝脏、睾丸和附睾的脏器系数，同时观察比较精子数量、存活率、活动率及精子形态的改变，评价咖啡对小鼠精子质量的急性影响，初步探讨咖啡对小鼠是否具有生殖毒性。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 选择 7～8周龄健康的 SPF级昆明种雄性小鼠40只，体重29～36 g，购自沈阳医学院实验动物中心。按体重随机分成 4个组别，即对照组10只、咖啡低剂量组10只、咖啡中剂量组10只和咖啡高剂量组10只。

1.2 主要仪器与试剂 MoticBA310-motic advanced 3.2显微成像系统（motic）；HH•S112恒温水浴箱（江苏省医疗器械）；JJ2000Y型电子天平（常熟市双杰测试仪器）。市售雀巢咖啡（东莞雀巢有限公司生产，批号：20160423），ART-1006精子冲洗培养液（Sage In-Vitro Fertilization，Inc.生产，批号：16190191），1%伊红溶液。

1.3 方法 咖啡浓度的设定参照成年人每天1杯咖啡的量，设定灌胃小鼠的低剂量为7.5 mg/kg，中剂量为15 mg/kg，高剂量为30 mg/kg。对照组为10 ml/kg的0.9%氯化钠注射液。每天定时给对照组小鼠0.3 ml 0.9%氯化钠注射液灌胃，给低、中、高剂量组小鼠分别以0.3 ml不同浓度的咖啡灌胃，连续灌胃7 d，7d后处死，检测相关指标。

1.4 体重变化测定 分别称量每只小鼠灌胃前的体重和灌胃7 d后的体重，体重变化（g）=灌胃后体重（g）－灌胃前体重（g）。

1.5 脏器系数测定 将小鼠摘眼球取血并脱臼处死，分离其肝脏、附睾和睾丸，分别称重，计算各脏器系数。脏器系数=脏器湿重（g）/小鼠体重（g）×100%。

1.6 精液质量分析 将分离的左侧附睾用眼科剪横切一次，纵切两次，放入EP管（0.2 ml精子缓冲液），放入37 ℃恒温箱30 min，待精子自由游出。

1.6.1 精子活动率和精子存活率 22 ℃室温下，取10 μl新鲜制备的精子悬液滴于血细胞计数板上，测量精子活率，10min内结束。将精子活动分为四级：Ⅰ级快速、直线的前向运动，Ⅱ级慢速或迟钝的直线或非直线前向运动，Ⅲ级不向前的运动，Ⅳ级不活动。精子活动率（%）=（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ）精子数/（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ）精子数×100%。精子存活率（%）=（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ）精子数/检查的精子数×100%。

1.6.2 精子计数 取精子悬液65 ℃水浴孵育10 min后，取10 μl于血细胞计数板计数池内，根据红细胞计数法，计数精子数，换算成精子相对密度进行比较。

1.6.3 精子畸形率 参考范瑞泉等[2]改良的方法，将剩余的精子悬液加入适量1%伊红溶液，混匀染色20 min后，取1滴于洁净玻片，均匀推片，空气中自然干燥，用中性树脂封片，制成精液样本片。在高倍镜下观察精子形态，记录畸形的精子数量，计算畸形率。精子畸形大致可分为卷曲、大头、双头、双尾、无钩、香蕉形等[3]。有头无尾、轮廓不清、重叠和明显被剪碎的精子不计。精子畸形率（%）=畸形的精子数/检查的精子数×100%。

1.7 统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件分析数据，计量资料以±s表示，组间比较用t检验均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体重变化比较 各组小鼠灌胃前后体重的变化如表 1所示，随着实验的进行，体重逐渐增加，咖啡低、中、高剂量组的小鼠体重增加值略低于对照组，但组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组小鼠灌胃前后的体重变化情况(g,±s)

表1 各组小鼠灌胃前后的体重变化情况(g,±s)

组别 只数 灌胃前 灌胃7 d 体重变化低剂量组 10 32.87±3.87 34.37±4.19 1.50±1.06中剂量组 10 32.27±7.30 33.91±7.70 1.64±1.27高剂量组 10 30.38±6.18 31.72±6.06 1.34±1.08对照组 10 30.34±5.93 32.18±6.59 1.84±1.24

2.2 脏器系数、睾丸系数和附睾系数比较 与对照组相比，咖啡低、中、高剂量组的小鼠肝脏系数均有不同的降低，但组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。低、中、高剂量组小鼠的睾丸系数和附睾系数与对照组相比持平或略有增大，无剂量-效应关系，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠的脏器系数比较(%,±s)

表2 各组小鼠的脏器系数比较(%,±s)

对照组 10 6.72±1.56 0.53±0.17 0.08±0.03组别 只数 肝脏系数 睾丸系数 附睾系数低剂量组 10 5.74±1.26 0.66±0.11 0.10±0.03中剂量组 10 6.64±1.73 0.52±0.10 0.08±0.02高剂量组 10 5.82±2.04 0.52±0.12 0.10±0.04

2.3 精液质量评价 ①精子相对密度：与对照组相比，咖啡中、高剂量组精子相对密度明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），但不存在明显的剂量-效应关系。低剂量组精子相对密度与对照组相差不大，差异无统计学意义（P＞0.05）。②精子存活率：与对照组相比，咖啡低剂量组精子存活率有增高趋势，中、高剂量组精子存活率略有降低，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。③精子活动率和畸形率：咖啡低、中、高剂量组精子活动率和畸形率均与对照组相近，无剂量-效应关系，差异无统计学意义（P＞0.05），见表 3。镜下检测可见多种类型的精子形态异常，如卷曲、小头、无定型、双尾和双头畸形等（图1）。

表3 各组小鼠的精液质量评价(±s)

表3 各组小鼠的精液质量评价(±s)

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别 只数精子存活率(%)精子活动率(%)精子相对密度精子畸形率(%)对照组 10 412.50±151.53 67.99±7.99 68.25±75.78 5.76±4.50低剂量组 10 433.50±170.15 73.33±5.99 68.48±63.56 6.49±3.33中剂量组 10 244.25±77.19*63.17±15.91 66.03±13.59 6.02±8.23高剂量组 10 221.00±137.37*67.98±9.91 64.56±16.72 5.44±2.12

图1 小鼠多种类型的精子形态（400×）

3 讨论

体重是动物实验中一项重要的非特异性指标，体重的变化可以综合地反映动物机体的中毒效应[4]。本实验对照组和咖啡各剂量组小鼠均正常生长，且活动状态良好，体重自然增长，咖啡低、中、高剂量组的小鼠体重增长均略低于对照组，差异不显著。短期灌胃咖啡未引起小鼠体重明显变化，可继续进行亚急性或长期试验研究。

脏器系数的变化通常可以较好地反映药物对该脏器的影响或者初步的毒性判断，也可以作为寻找毒物作用靶器官的重要线索[5]。经过咖啡连续灌胃7d后，咖啡低、中、高剂量组的小鼠肝脏系数、睾丸系数、附睾系数与对照组比较差异均无统计学意义，说明短期摄入咖啡对脏器影响不明显。

精液质量是评价雄性生育能力的最直观、最重要的指标，主要通过精子数量、精子活动率等参数来进行评估。精子数量减少、活动率下降以及畸形率升高往往会导致精子的受精能力下降，从而导致男性不育。本研究咖啡中、高剂量组与对照组比较，小鼠精子相对密度明显减少，即精子数量减少差异显著。表明咖啡对小鼠的精子数量有影响，连续7 d摄入咖啡大于15 mg/kg即可导致小鼠精子数量明显减少，但是其活动率、存活率和畸形率未受影响。精子数量减少，运动能力强的精子也相对减少。小鼠精子数量质量的降低，会减少精子到达并且进入卵子的机率，影响受精率，进而可能导致生殖率降低。而低剂量组小鼠精子数量和存活率大于对照组，其他指标两者也无显著差异，所以短期少量摄入咖啡对精子质量基本无影响，甚至有积极作用。

综上，短期过量摄入咖啡能明显减少小鼠精子数量，对精子存活率、活动率和畸形率影响不大。咖啡可能导致精液质量下降，对人类生殖健康的影响值得密切关注，并进一步研究。

[1]罗妙莎,董蕾,郭晓燕.咖啡与肝脏疾病[J].胃肠病学和肝病学杂志,2016,25(3):340-343.

[2]范瑞泉,魏青,丘钦英,等.小鼠精子畸形试验改良法与传统法效果比较[J].华南预防医学,2004,30(2):51-52.

[3]申涌,刘咏梅.枸杞多糖对甲醛所致雄性小鼠生殖毒性的拮抗作用[J].贵州医科大学学报,2017,42(4):440-443.

[4]田永刚,张迎梅.低剂量三聚氰胺对小鼠精子质量影响的研究[J].四川动物,2010,29(3):466-468.

[5]孙建新,安娟,连军.影响实验动物脏器重量及脏器系数因素分析[J].实验动物科学,2009,26(1):49-51.

10.12010/j.issn.1673-5846.2017.10.009

1沈阳医学院附属中心医院，辽宁沈阳 110024

2沈阳医学院，辽宁沈阳 110034

沈阳市卫生和计划生育委员会科研项目[沈卫办（2015）478号]

郭晓宁，硕士，主管药师。主要从事临床药学工作

王俊平，教授，博士。E-mail：greennasi@yahoo.com