内皮素拮抗剂对中波紫外线诱导豚鼠色素沉着的观察

傅祥评 庄永灿 王红兰

362000福建泉州，福建医科大学附属泉州市第一医院皮肤科

·研究报道·

内皮素拮抗剂对中波紫外线诱导豚鼠色素沉着的观察

傅祥评 庄永灿 王红兰

362000福建泉州，福建医科大学附属泉州市第一医院皮肤科

目的探讨内皮素拮抗剂对紫外线诱导豚鼠色素沉着的治疗作用。方法用中波紫外线（UVB）照射豚鼠皮肤制作色素沉着模型。模型制作成功后，模型动物分为空白对照组（生理氯化钠溶液）、内皮素拮抗剂组及熊果苷组（阳性对照）。分别于中波紫外线（UVB）照射前、15 d后及30 d后，用Mexameter®MX 18检测豚鼠背部皮肤的黑素指数。连续治疗30 d后比较黑素指数、表皮内黑素细胞数目和黑素含量等指标。结果UVB照射30 d时，豚鼠背部9块UVB照射区域的黑素指数显著高于照射前（P＜0.000 1）。外涂1‰内皮素拮抗剂的照射区域30 d后的黑素指数值明显降低，和熊果苷组比较，差异有统计学意义（P＜0.000 1）。内皮素拮抗组黑素含量指数1明显低于空白对照组（P＜0.05）。而3组间黑素含量指数2差异无统计学意义（P＞0.05）。结论外涂内皮素拮抗剂对UVB照射诱导豚鼠的色素沉着有一定治疗作用。

紫外线；色素沉着；治疗应用；豚鼠；内皮素拮抗剂

过度的紫外线照射会造成皮肤细胞内活性氧自由基增加，损伤皮肤内的脂质、蛋白和核酸，皮肤会出现红斑、水肿、增生、光老化，最终形成色素沉着。目前的研究表明，皮肤美白物质如熊果苷、曲酸、维生素C衍生物等能减轻紫外线引起的皮肤损伤，抑制黑素细胞合成黑素而减淡肤色［1⁃3］。研究发现，与非紫外线暴露区皮肤组织相比，紫外线暴露区内皮素和多巴氧化酶的表达较高，而酪氨酸羟化酶较低［4］。因此，我们推测应用内皮素拮抗剂对紫外线诱导所产生的色素沉着可能有治疗作用。本研究通过在成年雌性豚鼠皮肤使用中波紫外线（UVB）照射制作色素沉着模型，观察涂抹内皮素拮抗剂对色素反应程度、表皮内黑素细胞数目和黑素含量等指标的影响，探讨局部涂抹内皮素拮抗剂对UVB引起的豚鼠色素沉着的治疗作用。

一、材料与方法

（一）主要试剂：内皮素拮抗剂（浓度为1‰）购于上海奥利实业有限公司，熊果苷购于上海奥利实业有限公司。

（二）方法：

1.模型制作及实验分组：20只250 g成年雌性豚鼠JY2011A16（合格证号0248335）购于福建医科大学实验动物中心。紫外光辐照计对UV236B紫外线治疗仪进行能量监测，监测结果发现，距离紫外线治疗仪5 cm处，紫外线的能量强度为5.5 mW/cm2，该强度用于后续的模型制作。将每只豚鼠背部设定9个相离区域，每个区域为1 cm×1 cm，光斑间隔为0.5 cm。每3个为1组，取平均值（图1）。每次照射前用剪刀剪除豚鼠背部面积为4 cm×4 cm的长毛，电动剃须刀剃尽短毛。实验分为空白对照组（生理氯化钠溶液）、内皮素拮抗剂组及熊果苷组（阳性对照）3个组。先对10只豚鼠背部皮肤进行紫外线照射30 d构建色素沉着模型，后外涂1‰的内皮素拮抗剂或1‰熊果苷及生理氯化钠溶液30 d，分别从大体和镜下观察豚鼠皮肤颜色的变化。

2.黑素指数（melanin index，MI）测定：使用Mexameter®MX 18测量豚鼠背部皮肤的颜色。分别于照射前、照射15 d、照射30 d后测定各部位的色素指数，每个部位测4个点，取平均值作为该点的MI。为了分析内皮素拮抗剂的治疗作用，研究中比较各组间MI下降值（MI下降值=MI治疗30d-MI治疗前）。

3.皮肤取材：20只豚鼠背部的实验区域A～I分别取相同大小的皮肤进行活检。分成2份：分别福尔马林固定后石蜡包埋，立即放入-80℃冰箱冻存。

4.Masson⁃Fontana银染色法：观察3组中黑素颗粒的数量和分布部位，评价黑素合成情况。基本步骤为：豚鼠背部9块区域皮肤组织各取一小块经4%甲醛溶液固定，按常规石蜡包埋、切片；将上述切片常规脱蜡；后经氨银液置室温下避光浸染16 h；蒸馏水洗2 min。0.2%氯化金水溶液处理8 min；5%硫代硫酸钠水溶液固定5 min；中性红液复染。黑素及嗜银细胞颗粒呈黑色，其他组织呈复染的颜色。黑素合成的评价标准：共分为5级。1级为基底层细胞和棘层偶见黑素颗粒；2级为黑素分布以基底层为主，且黑素颗粒分布不连续；3级为基底层细胞和棘层均可见连续呈带状分布的黑素颗粒；4级为基底层棘层可见大量连续呈带状分布的黑素颗粒，且角质形成细胞内可见较多黑素帽（帽状附着于细胞核的黑素颗粒）；5级为表皮全层密布黑素颗粒，可见较多黑素帽。

5.黑素含量指数（melanin content index，MCI）测定：用Image J Launcher分析系统对Masson⁃Fontanas银染色切片进行MCI计算。MCI⁃1：选择10处表皮，测定受检表皮基底层内黑素颗粒面积占受检基底层细胞总面积的百分比平均值。MCI⁃2：选择10处表皮，测定受检表皮基底层以上各层黑素颗粒面积占受检基底层以上各层细胞总面积的百分比均值。

6.统计学方法：采用SAS 6.1.76统计软件，计量资料数据用±s表示，采用成组t检验和方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 实验设计及分组 将每只豚鼠背部设定9个区域，每个区域为1 cm×1 cm，光斑间隔0.5 cm。每3个1组

二、结果

图2 UVB照射前（2A），照射30 d（2B）豚鼠背部皮肤颜色变化

1.紫外线诱导色素沉着动物模型的构建及MI测定：10只豚鼠背部皮肤的最小红斑量200～300 mJ/cm2。肉眼观察UVB照射前和照射30 d后豚鼠背部皮肤颜色变化，可看到豚鼠背部皮肤颜色明显加深（图2）。UVB照射期间未发现明显不良反应，如水肿、鳞屑、坏死等。分别于UVB照射前、15 d后及30 d后，用Mexameter MX 18检测豚鼠背部皮肤的色素指数。照射前、15 d、30 d后的MI值不断上升。

2.内皮素拮抗剂对紫外线诱导色素沉着的治疗：30 d UVB照射10只豚鼠成功构建色素沉着模型后，外用1‰内皮素拮抗剂或1‰熊果苷，每日1次，共30 d，比较色素沉着退却的程度，即计算1‰内皮素拮抗组（A-C区域）外涂前和外涂30 d后豚鼠背部皮肤的MI下降值。结果显示3组的MI下降值分别为：空白组67.19±49.65；内皮素拮抗剂121.90±64.71；熊果苷组89.10±41.34。内皮素拮抗组的MI下降值和空白组比较，差异有统计学意义（F＝5.71，P＜0.05）。而1‰熊果苷组的MI下降值大于空白组，但差异无统计学意义（P＞ 0.05）。

3.MCI计数及黑素合成评价：通过切片经Masson⁃Fontana银染色（图3），发现内皮素拮抗剂组中黑素合成等级多为1～2级，表现为基底层细胞和棘层偶见黑素颗粒，黑素分布以基底层为主，且黑素颗粒分布不连续。而熊果苷和空白组的黑素合成等级多为3～4级，表现为基底层棘层可见大量连续呈带状分布的黑素颗粒，且角质形成细胞内可见较多黑素帽。MCI⁃1在各组的数值为：空白组0.48±0.177；内皮素拮抗剂组0.25± 0.084；熊果苷组0.44± 0.112。MCI⁃2在各组的数值为：空白组0.04±0.039；内皮素拮抗剂组0.03±0.022；熊果苷组0.07±0.039。经方差分析比较，3组间MCI⁃1的差异有统计学意义（P＜0.05）。内皮素拮抗治疗组中MCI⁃1明显低于空白对照治疗组。但3组间MCI⁃2差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 豚鼠皮肤Masson⁃Fontanas银染色，表真皮交界处黑褐色染色代表黑素（×200） 内皮素拮抗剂组中黑素合成等级多为1～2级，表现为基底层细胞和棘层偶见黑素颗粒，黑素分布以基底层为主，且黑素颗粒分布不连续。而熊果苷组和空白对照组的黑素合成等级多为3～4级，表现为基底层棘层可见大量连续呈带状分布的黑素颗粒，且角质形成细胞内可见较多黑素帽

三、讨论

皮肤色素沉着的发生主要与以下几个环节有关：①酪氨酸酶的含量与活性；②黑素体的合成速度与黑化程度；③黑素体向角质形成细胞的转输效能；④黑素体在角质形成细胞内的降解速度等［5］。体外恶性黑素瘤细胞培养实验证明［6］，特异性内皮素B拮抗剂BQ788能够显著抑制黑素瘤细胞的增殖并诱导分化。本次实验所用的是成年雌性豚鼠，棕黄色豚鼠体内黑素细胞、黑素小体在表皮的分布类似于人体［7］，UVB照射豚鼠作为皮肤色素沉着实验动物模型已被广泛接受并应用。但有关UVB照射方法与照射量不尽相同，有研究采用一次性大剂量照射［8］，有些为避免急性损伤如红斑、脱屑等采用小剂量重复照射［9］。本研究通过预实验最后确定隔日最小红斑量小剂量照射，既可出现明显色素沉着，又不造成严重急性损伤。我们用UVB照射诱导豚鼠皮肤色素沉着作为动物模型，对内皮素拮抗剂进行了效果观察，并与传统美白剂熊果苷进行比较。

熊果苷是1988年日本学者从杜鹃花科植物熊果的叶中分离到的一种具有脱色作用的单体物质，是氢醌的一种天然存在形式。其脱色作用可能与分子结构中存在的氢醌基团有关。有研究表明，熊果苷在人体去色素的机制涉及黑素体中酪氨酸酶活性的抑制，而不是酪氨酸酶的表达和合成［10］。目前它在化妆品中的添加用量约为3%，小于此量对皮肤中酪氨酸酶的催化活性的抑制作用较弱，增白效果不明显；但是大于此量能抑制或者损伤细胞生长，从而产生细胞毒性。本实验设定的熊果苷浓度与所用的内皮素拮抗剂一致，从而更好地比较分析两者对黑素的作用。本研究结果提示：UVB照射30 d后，豚鼠背部UVB照射区域的MI显著高于未照射区域。与空白对照组和外涂1‰熊果苷组相比，外涂1‰内皮素拮抗剂共30 d（每日1次）后，豚鼠背部皮肤黑素指数明显降低，说明内皮素拮抗剂对UVB引起的色素沉着有治疗作用。取3组皮肤活检并进行镜下观察发现：同其他组比较，内皮素拮抗剂组的MCI⁃1明显降低，即内皮素拮抗剂组的表皮基底层内黑素颗粒明显减少。本研究结果显示，外涂1‰内皮素拮抗剂对UVB照射诱导的色素沉着有治疗作用。但是治疗的相关机制需要进一步研究。

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Therapeutic effect of an endothelin antagonist on ultraviolet B⁃induced pigmentation in guinea pigs

Fu Xiangping,Zhuang Yongcan,Wang Honglan
Department of Dermatology,Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University,Quanzhou 362000,Fujian,China

Fu Xiangping,Email:fxp8398@126.com

ObjectiveTo evaluate the therapeutic effect of endothelin antagonist on ultraviolet B（UVB）⁃induced pigmentation in guinea pigs.MethodsA skin pigmentation model was established by UVB irradiation in guinea pigs.The modeled animals were divided into 3 groups to be treated with sodium chloride physiological solution（blank control group）,an endothelin antagonist（endothelin antagonist group）and arbutin（positive control group）,respectively.Before the UVB irradiation,as well as after 15⁃and 30⁃day UVB irradiation,Mexameter®MX 18 was used to detect the melanin index in the dorsal skin of guinea pigs.After 30⁃day consecutive treatment,melanin index,the number of melanocytes in the epidermis and melanin content were compared among the above 3 groups.ResultsAfter 30⁃day UVB irradiation,the melanin index in the 9 UVB⁃irradiated areas on the dorsal skin of guinea pigs significantly increased compared with that before the radiation（P＜ 0.0001）.After 30⁃day treatment with the 1‰ endothelin antagonist,the melanin index in the UVB⁃irradiated areas significantly decreased compared with that in the positive control group（P＜ 0.0001）.Melanin content index⁃1（MCI⁃1）was significantly lower in the endothelin antagonist group than in the blank control group（P＜ 0.05）,while no significant difference in MCI⁃2 was observed among the 3 groups（P＞ 0.05）.ConclusionTopical application of the endothelin antagonist has a certain therapeutic effect on UVB⁃induced pigmentation in guinea pigs.

Ultraviolet rays;Pigmentation;Therapeutic uses;Guinea pigs;Endothelin antagonist

傅祥评，Email：fxp8398@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.06.011

泉州市财政局科技计划项目（2013Z70）

Fund program:Science and Technology Planning Project of Quanzhou Municipal Bureau of Finance（2013Z70）

2017⁃03⁃01）

（本文编辑：吴晓初）