葫芦素I对HaCaT细胞体外增殖及对角蛋白17、STAT3、VEGF表达的影响

姚秋楠 魏志平 刘彦群

221002江苏，徐州医科大学附属医院皮肤科（第三作者现在江苏省医学会）

葫芦素I对HaCaT细胞体外增殖及对角蛋白17、STAT3、VEGF表达的影响

姚秋楠 魏志平 刘彦群

221002江苏，徐州医科大学附属医院皮肤科（第三作者现在江苏省医学会）

目的探讨葫芦素I对HaCaT细胞体外增殖及角蛋白17（K17）、信号转导及转录激活子3（STAT3）、血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法采用不同浓度葫芦素I（0.0125、0.025、0.05、0.1 μmol/L）、含与0.1 μmol/L葫芦素I等体积DMSO的DMEM培养液（溶媒组）、DMEM培养液（阴性对照组）、10 nmol/L卡泊三醇（阳性对照组）分别作用于HaCaT细胞。采用CCK8法检测葫芦素I作用12、24、36 h后对HaCaT细胞体外增殖的影响，RT⁃PCR法检测葫芦素I作用24 h对HaCaT细胞K17和VEGF mRNA表达的影响，Western印迹法检测葫芦素I作用24 h对HaCaT细胞K17、STAT3、磷酸化STAT3（P⁃STAT3）和VEGF蛋白表达的影响。结果0.0125 μmol/L葫芦素I作用12 h即开始表现出对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用，当葫芦素I浓度增加到0.1 μmol/L时，24 h和36 h的抑制率分别为43.00%±2.11%和48.98%±2.27%。与阴性对照组相比，各浓度葫芦素I组对HaCaT细胞体外增殖均有抑制作用（均P＜0.05），且该抑制作用随葫芦素I浓度的增加及作用时间的延长逐渐增强。不同浓度葫芦素I作用于HaCaT细胞24 h后，K17 mRNA及其蛋白、P⁃STAT3蛋白、VEGF mRNA及其蛋白表达量均随葫芦素I浓度的增加而降低，差异有统计学意义（均P＜0.05）。结论葫芦素I可抑制HaCaT细胞的体外增殖，并可在mRNA水平下调K17、VEGF的表达，在蛋白水平下调K17、P⁃STAT3、VEGF的表达。

葫芦素类；角蛋白17；STAT3转录因子；血管内皮生长因子类；HaCaT细胞

葫芦素I是从葫芦科植物中提取出来的一种四环三萜类复合物，可抑制多种肿瘤细胞增殖、粘附、迁移及血管生成，并可抑制信号转导及转录激活子3（STAT3）磷酸化［1］。角蛋白17（K17）是一个含432个氨基酸的结构蛋白，由中间的α螺旋杆状域和两侧的非螺旋头域及尾域三部分构成［2］。研究发现，银屑病皮损中活化的角质形成细胞过表达K17，而正常皮肤与非银屑病皮损中K17表达无明显增高，因此认为K17是银屑病的标志之一［3］。许多研究已表明角质形成细胞中K17可依赖STAT3活化途径表达上调。本实验研究了葫芦素I对HaCaT细胞体外增殖及对K17、STAT3、血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响，旨在探讨葫芦素I能否成为治疗银屑病的潜在药物及其可能的作用机制。

材料与方法

一、细胞与试剂

人永生化角质形成细胞株HaCaT细胞（上海复祥生物科技有限公司），葫芦素I（批号14747，纯度 ≥98%，美国Cyagen公司），卡泊三醇（批号VICI1532，纯度＞98%，徐州微科曼得生物工程有限公司），DMEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），Cell Counting Kit⁃8（CCK⁃8）试剂盒（上海碧云天生物技术研究所），鼠抗人STAT3单克隆抗体、兔抗人磷酸化STAT3（P⁃STAT3）单克隆抗体（Tyr705）（美国Cell Sighaling公司），兔抗人K17单克隆抗体、兔抗人GAPDH单克隆抗体（美国Abcam公司），兔抗人VEGF多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），辣根酶标记山羊抗小鼠IgG、辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），反转录及PCR试剂盒（北京天根生化科技有限公司产品）。RT⁃PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计。

二、细胞培养及实验分组

HaCaT细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的高糖DMEM培养液中，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养。待细胞长满瓶底后，以含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，接种于培养瓶内，置培养箱中培养24 h贴壁后，更换无血清、无双抗DMEM培养液，并加入不同浓度葫芦素I。根据Kim等［4］选用的葫芦素I浓度梯度及我们的预实验结果，最终将实验分为0.0125、0.025、0.05、0.1 μmol/L葫芦素I组、溶媒组（含与0.1 μmol/L葫芦素I等体积DMSO的DMEM培养液）、阴性对照组（DMEM培养液）和阳性对照组（10 nmol/L卡泊三醇）［5］。

三、CCK8法检测葫芦素I对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用

取HaCaT细胞9×103/ml接种于96孔培养板，每孔100 μl，培养24 h。细胞贴壁后，实验分组同上，每组设6个复孔，分别培养12、24、36h后终止培养。弃去原培养基，将无血清、无双抗DMEM培养液与CCK⁃8试剂按10∶1比例混匀，每孔加入100 μl混匀液，于培养箱中孵育2 h，酶标仪测定450 nm波长处每孔的吸光度（A）值，实验重复3次取均值，计算细胞增殖抑制率=（1－给药组A值/阴性对照组A值）×100%。

四、Western印迹法测定HaCaT细胞K17、STAT3、P⁃STAT3及VEGF的表达

取对数生长期的HaCaT细胞以1×105/ml置于100 ml培养瓶中，每瓶10 ml，待细胞贴壁生长后，弃去原培养基，按上述实验分组进行实验。培养24 h后收集各组细胞，提取总蛋白，用BCA法检测蛋白浓度，上样80 μg进行电泳、转膜及封闭，一抗（鼠抗人STAT3单克隆抗体滴度为1∶1 000，兔抗人P⁃STAT3单克隆抗体为1∶2 000，兔抗人K17单克隆抗体为1∶4 000，兔抗人VEGF多克隆抗体为1∶300，兔抗人GAPDH单克隆抗体为1∶9 000）孵育4℃过夜，二抗（辣根酶标记山羊抗小鼠IgG抗体滴度及辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体均为1∶500）孵育2 h，ECL发光液显色，暗室曝光观察结果。目的蛋白条带STAT3、P⁃STAT3、K17、VEGF与相应的内参照GAPDH条带的灰度值比值作为其蛋白表达的半定量指标。

五、RT⁃PCR法测定HaCaT细胞K17及VEGF的表达

选用对数生长期HaCaT细胞，以1×105/ml接种于6孔板，每孔2 ml，培养24 h后，弃去原培养基，按上述实验分组进行实验。各组细胞培养24 h后提取细胞总RNA，反转录合成cDNA。目的基因K17正向引物5′⁃CCTGGCGGAGACAGAGAAC⁃3′，反向引物 5′⁃GATGACCTTGCCATCCTGGAC⁃3′，扩增片段为283 bp；VEGF正向引物5′⁃GGCAAAGTGAGTG ACCTGCT⁃3′，反向引物5′⁃AGAACAGCCCAGAAGT TGGA⁃3′，扩增片段为273 bp；内参照β肌动蛋白正向引物5′⁃TGACGTGGACATCCGCAAAG⁃3′，反向引物5′⁃CTGGAAGGTGGACAGCGAGG ⁃3′，扩增片段为205 bp。PCR反应体系为25 μl，扩增条件为：K17和VEGF：94℃预变性3 min，94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸5 min；β肌动蛋白：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸5 min。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统扫描拍照，检测各电泳条带的灰度值，计算与β肌动蛋白比值，得到目的产物的相对含量。

图1 不同浓度葫芦素I作用HaCaT细胞12、24、36 h后对其体外增殖的抑制作用

表1 不同浓度葫芦素I作用HaCaT细胞12、24、36 h后对其体外增殖的抑制作用（±s）

表1 不同浓度葫芦素I作用HaCaT细胞12、24、36 h后对其体外增殖的抑制作用（±s）

注：n=3。A值：吸光度值；a：与阴性对照组相比，P ＜ 0.05；b：与卡泊三醇组相比，P ＜ 0.05

组别阴性对照组溶媒组0.0125 μmol/L葫芦素I组0.025 μmol/L葫芦素I组0.05 μmol/L葫芦素I组0.1 μmol/L葫芦素I组卡泊三醇组12 h A值0.924±0.037 0.914±0.037 0.860±0.031ab 0.779±0.024ab 0.700±0.020ab 0.622±0.015a 0.640±0.013a抑制率（%）0 1.04±0.33 6.94±1.14ab 15.70±2.12ab 24.17±2.10ab 32.68±1.79a 30.73±1.94a 24 h A值0.780±0.039 0.768±0.039 0.670±0.035ab 0.576±0.036ab 0.522±0.041ab 0.444±0.019a 0.462±0.015a抑制率（%）0 1.58±0.55 14.08±1.33ab 26.17±2.37ab 33.14±2.80ab 43.00±2.11a 40.63±2.22a 36 h A值0.578±0.046 0.567±0.047 0.472±0.035ab 0.396±0.031ab 0.350±0.032ab 0.295±0.024a 0.306±0.028a抑制率（%）0 1.86±0.77 18.22±1.66ab 31.35±1.70ab 39.46±2.61ab 48.98±2.27a 47.02±2.96a

六、统计学分析

采用SPSS16.0统计软件进行分析，计量资料用±s表示。各组HaCaT细胞增殖抑制率随时间的变化采用重复测量的方差分析，RT⁃PCR法和Western印迹法测定结果采用单因素方差分析，相关分析用Spearman相关分析，并用相关系数rs表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、葫芦素I对HaCaT细胞体外增殖的影响

重复测量的方差分析显示，时间因素主效应有统计学意义（F=2628.8，P＜ 0.05），说明HaCaT细胞体外增殖的抑制率有随时间变化的趋势；药物浓度与时间之间存在交互效应（F=2.93，P＜0.05），说明各组HaCaT细胞的增殖抑制率随时间变化的趋势不同；分组因素也起作用（F=534.195，P＜0.05），说明不同分组间HaCaT细胞的增殖抑制率总体而言不同。0.0125 μmol/L葫芦素I作用12 h即开始表现出对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用（图1）。与阴性对照组相比，各浓度葫芦素I组对HaCaT细胞体外增殖有抑制作用（均P＜0.05，表1），且各浓度葫芦素I组间比较差异有统计学意义（均P＜0.05），葫芦素I浓度越高，抑制作用越强。随作用时间延长，各葫芦素I对HaCaT细胞增殖的抑制作用亦逐渐增强，12～24 h与24～36 h两个时间段相比，前者抑制率上升更快（图1），故选择24 h为后续实验的时间点。各时间点溶媒组HaCaT细胞体外增殖的抑制率与阴性对照组相比，差异无统计学意义（均P＞0.05），故可排除溶媒DMSO对本实验结果的影响。各时间点卡泊三醇组HaCaT细胞体外增殖抑制率与0.1 μmol/L葫芦素I组差异无统计学意义（P＞0.05），但显著高于其他3个葫芦素I组（P＜ 0.05）。

二、葫芦素I对HaCaT细胞K17 mRNA及其蛋白表达的影响

不同浓度葫芦素I作用HaCaT细胞24 h后，K17 mRNA及蛋白的表达量随葫芦素I浓度的增加不断降低（表2，图2），各组K17 mRNA及蛋白相对表达量差异均有统计学意义（F=45.972、41.219，均P＜0.05）。与阴性对照组相比，各浓度葫芦素I及卡泊三醇均能显著降低HaCaT细胞K17 mRNA及蛋白的表达（均P＜0.05），而溶媒组与阴性对照组相比差异无统计学意义（P＞ 0.05）。0.0125、0.025、0.05 μmol/L葫芦素I对HaCaT细胞K17 mRNA及蛋白表达的抑制作用显著弱于卡泊三醇（均P＜0.05），而0.1 μmol/L葫芦素I组与卡泊三醇阳性对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。相关分析显示，葫芦素I下调K17 mRNA及其蛋白表达的作用随着葫芦素I浓度增加而逐渐增强（rs=-0.950、-0.972，均P＜ 0.05）。

三、葫芦素I对HaCaT细胞STAT3及P⁃STAT3蛋白表达的影响

不同浓度葫芦素I作用HaCaT细胞24 h后，各组STAT3蛋白表达情况基本一致，而各组P⁃STAT3蛋白的表达则明显下调（图3）。与阴性对照组相比，各浓度葫芦素I组及卡泊三醇组HaCaT细胞P⁃STAT3/STAT3均显著降低（P＜0.05），而溶媒组与阴性对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。0.0125、0.025、0.05 μmol/L葫芦素I对HaCaT细胞P⁃STAT3蛋白的抑制作用明显低于卡泊三醇，差异有统计学意义（P＜0.05），而0.1 μmol/L葫芦素I组与卡泊三醇阳性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。相关分析显示，随葫芦素I浓度的增加，P⁃STAT3蛋白的表达逐渐降低（r=-0.951，P＜0.05）。

表2 不同浓度葫芦素I作用HaCaT细胞24 h后对角蛋白17、血管内皮生长因子mRNA和蛋白以及STAT3、P⁃STAT3蛋白表达的影响（±s）

表2 不同浓度葫芦素I作用HaCaT细胞24 h后对角蛋白17、血管内皮生长因子mRNA和蛋白以及STAT3、P⁃STAT3蛋白表达的影响（±s）

注：n=3。a：与阴性对照组相比，P ＜ 0.05；b：与卡泊三醇组相比，P ＜ 0.05

组别P⁃STAT3/STAT3阴性对照组溶媒组0.0125 μmol/L葫芦素I组0.025 μmol/L葫芦素I组0.05 μmol/L葫芦素I组0.1 μmol/L葫芦素I组卡泊三醇组F值P值角蛋白17 mRNA 1.039±0.022 1.030±0.051 0.856±0.095ab 0.712±0.073ab 0.560±0.050ab 0.362±0.088a 0.411±0.088a 45.972＜0.05蛋白1.023±0.089 1.020±0.081 0.830±0.059ab 0.666±0.040ab 0.517±0.051ab 0.362±0.074a 0.369±0.114a 41.219＜0.05血管内皮生长因子mRNA 0.899±0.077 0.873±0.087 0.717±0.064ab 0.562±0.070ab 0.436±0.034a 0.299±0.058a 0.343±0.081a 37.463＜0.05蛋白0.926±0.071 0.945±0.058 0.757±0.073ab 0.573±0.015ab 0.408±0.081a 0.221±0.103a 0.278±0.159a 32.974＜0.05 0.860±0.028 0.889±0.026 0.726±0.048ab 0.585±0.068ab 0.398±0.125ab 0.269±0.063a 0.240±0.077a 45.467＜0.05

图2 不同浓度葫芦素I作用HaCaT细胞24 h后K17蛋白的表达 1：阴性对照组；2：溶媒组；3 ～ 6：分别为0.0125、0.025、0.05、0.1 μmol/L葫芦素I组；7：10 nmol/L卡泊三醇组

图3 不同浓度葫芦素I作用HaCaT细胞24 h后P⁃STAT3、STAT3蛋白的表达 1：阴性对照组；2：溶媒组；3～6：分别为0.0125、0.025、0.05、0.1 μmol/L葫芦素I组；7：10 nmol/L卡泊三醇组

四、葫芦素I对HaCaT细胞VEGF mRNA及蛋白表达的影响

不同浓度葫芦素I作用HaCaT细胞24 h后，各组VEGF mRNA及蛋白的相对表达量差异均有统计学意义（F=37.463、32.974，均P＜ 0.05），见表2。与阴性对照组相比，各浓度葫芦素I及卡泊三醇均能显著降低HaCaT细胞VEGF mRNA及蛋白的表达（均P＜0.05），而溶媒组与阴性对照组相比差异无统计学意义（P＞ 0.05）。0.0125、0.025 μmol/L葫芦素I对HaCaT细胞VEGF mRNA及蛋白表达的抑制作用显著低于卡泊三醇（均P＜ 0.05），而0.05、0.1 μmol/L葫芦素I组与卡泊三醇阳性对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。相关分析显示，随葫芦素I浓度的增加，VEGF mRNA及其蛋白表达逐渐下降（rs=-0.972、-0.970，均P＜ 0.05）。

讨 论

在传统医学中，葫芦素用于解热、止痛、抗炎、抗菌、抗肿瘤活性，葫芦素I可有效抑制多种人类癌细胞生长，包括恶性胶质瘤细胞、肝癌细胞、鼻咽癌细胞和前列腺癌细胞等［6］。已经证实葫芦素I可有效抑制血管生成，并能显著抑制STAT3信号活化［1］，而该信号的活化在银屑病的发生发展中有着重要的作用。研究表明［7］，角质形成细胞中活化的STAT3信号直接影响银屑病皮损的病理发展，STAT3是一种潜在的胞质蛋白，当受到白细胞介素6（IL⁃6）、IL⁃11、表皮生长因子（EGF）等其他细胞因子及生长因子刺激后，被羧基末端Tyr705残基磷酸化而激活，磷酸化反应之后，STAT3转移至核内连接特异性STAT3靶基因启动子反应元件，调节转录。

K17是一种存在于复层上皮如指甲、头皮毛囊、皮脂腺及小汗腺的中间丝蛋白，研究发现，K17在银屑病皮损中高表达，而在正常皮肤与非银屑病皮损中的表达无明显增高［5］。Zhang等［8］研究表明，角质形成细胞中IL⁃22可通过激活STAT3以剂量依赖方式上调K17的表达，这种上调可以被STAT3特异性抑制剂白皮杉醇以及小干扰RNA（siRNA）部分抑制，该研究也证实了角质形成细胞中K17依赖STAT3机制上调表达，加速银屑病的发展。K17分子中至少有5个银屑病相关T细胞表位，有些表位与ALEEAN序列类似，故K17可作为一种自身抗原，其表位可以激活T细胞（如Th1细胞、Th17细胞以及产生IL⁃22的T细胞）的增殖，活化的T细胞产生银屑病相关细胞因子干扰素γ（IFN⁃γ）、IL⁃17、IL⁃22等，这些细胞因子又可以依赖上述信号通路激活角质形成细胞表达K17，继而形成了一个反馈环路再次激活T细胞增殖和银屑病相关细胞因子的产生，这个反馈环路即K17/T细胞/细胞因子自身免疫环路［9］，参与银屑病的发生发展。

本研究采用CCK8法检测到不同浓度葫芦素I对HaCaT细胞体外增殖均有抑制作用，12～24 h时间段较24～36 h时间段抑制率上升的更快，0.1 μmol/L葫芦素I作用36h抑制率达48.98%±2.27%。RT⁃PCR法和Western印迹法表明，葫芦素I可下调K17 mRNA和蛋白以及P⁃STAT3蛋白的表达，且随葫芦素I浓度增加，下调作用增强。相关性分析表明，P⁃STAT3与K17蛋白表达量之间成正相关（r=0.959，P＜ 0.05），推测葫芦素I可能抑制STAT3信号通路的磷酸化，阻断STAT3向核内转移，从而阻止磷酸化STAT3与K17启动子结合，使得K17表达量下降，进而阻断K17/T细胞/细胞因子这个自身免疫环路。

VEGF在银屑病发病机制中是一个重要的血管生成调节剂，在银屑病患者皮损斑块及血浆中均呈高水平，血清VEGF水平与银屑病病情严重程度具有相关性［10］。研究证明［11］，活化的STAT3可以上调VEGF的表达并促进血管生成，Qi等［1］研究表明葫芦素I可通过降低STAT3活化抑制乳腺癌的血管生成。本研究RT⁃PCR法和Western印迹法检测结果显示，不同浓度葫芦素I可下调VEGF mRNA及蛋白的表达，同时也发现P⁃STAT3与VEGF蛋白表达量之间成正相关（r=0.928，P＜ 0.05），进一步证明STAT3可以上调VEGF的表达。

综上所述，本研究发现，葫芦素I可抑制HaCaT细胞体外增殖，同时在mRNA水平下调K17、VEGF的表达 ，在蛋白水平下调K17、P⁃STAT3、VEGF的表达。本研究结果只能初步为葫芦素治疗银屑病提供部分实验和理论依据，但其能否成为该病治疗的一种新型药物，尚需进一步研究。

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Effects of cucurbitacin I onin vitroproliferation of HaCaT cells and the expression of keratin 17,signal transducer and activator of transcription 3 and vascular endothelial growth factor

Yao Qiunan,Wei Zhiping,Liu Yanqun
Department of Dermatology,The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University,Xuzhou 221002,Jiangsu,China（The current affiliation of the third author was Jiangsu Medical Association）

Wei Zhiping,Email:xzwzp1961@aliyun.com

ObjectiveTo evaluate effects of cucurbitacin I onin vitroproliferation of HaCaT cells and the expression of keratin 17（K17）,signal transducer and activator of transcription 3（STAT3）and vascular endothelial growth factor（VEGF）in cultured HaCaT cells.MethodsIn vitrocultured HaCaT cells were divided into 6 groups to be treated with cucurbitacin I at different concentrations of 0.0125,0.025,0.05 and 0.1 μmol/L （0.0125,0.025,0.05 and 0.1 μmol/L cucurbitacin I groups）,DMEM containing the same volume of DMSO as 0.1 μmol/L cucurbitacin I（DMSO group）,DMEM（negative control group）and 10 nmol/L calcipotriol（positive control group）,respectively.Cell counting kit⁃8（CCK8）assay was performed to assessin vitrocellular proliferative activity after 12 ⁃,24 ⁃,36 ⁃hour treatment,reverse transcription（RT）⁃PCR to measure the mRNA expression of K17 and VEGF in HaCaT cells after 24⁃hour treatment,and Western blot analysis to determine the protein expression of K17,STAT3,phosphorylated⁃STAT3（p⁃STAT3）and VEGF after 24⁃hour treatment.Statistical analysis was carried out by one⁃way analysis of variance（ANOVA）,repeated measures ANOVA,Student⁃Newman⁃Keuls（SNK）⁃qtest and Pearson correlation analysis.ResultsThe proliferative activity of HaCaT cells started to decrease after 12⁃hour treatment with cucurbitacin I at the concentration of 0.0125 μmol/L.When the concentration of cucurbitacin I increased up to 0.1 μmol/L,the cell proliferation rates were inhibited by 43.00% ± 2.11%and 48.98% ± 2.27%after 24⁃and 36⁃hour treatment respectively.Compared with the negative control group,cucurbitacin I at different concentrations all could inhibitin vitroproliferation of HaCaT cells（allP＜ 0.05）,and the inhibitory effects increased gradually with the increase of cucurbitacin I concentration and treatment duration.After 24⁃hour treatment,the mRNA expression of K17 and VEGF and the protein expression of K17,VEGF and P⁃STAT3 were significantly decreased along with the increase of concentration of cucurbitacin I（allP＜ 0.05）.ConclusionCucurbitacin I can inhibitin vitroproliferation of HaCaT cells,and down⁃regulate the mRNA expression of K17 and VEGF and protein expression of K17,VEGF and P⁃STAT3.

Cucurbitacins;Keratin⁃17;STAT3 transcription factor;Vascular endothelial growth factors;HaCaT cells

魏志平，Email：xzwzp1961@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.06.010

2016⁃09⁃06）

（本文编辑：颜艳）