1型神经纤维瘤病NF1基因突变检测

吉津 郭琴 章若画 李明

210000南京中医药大学附属江苏省中医院皮肤科（吉津、郭琴、章若画）；上海交通大学附属新华医院皮肤科（李明）

1型神经纤维瘤病NF1基因突变检测

吉津 郭琴 章若画 李明

210000南京中医药大学附属江苏省中医院皮肤科（吉津、郭琴、章若画）；上海交通大学附属新华医院皮肤科（李明）

目的检测1例1型神经纤维瘤病（NF1）患者NF1基因的突变。方法采用PCR和DNA测序法检测1例NF1患者、2例直系亲属及100例无亲缘关系的正常人NF1基因突变。结果在NF1患儿中检测到1个移码突变c.3822delC，患者直系亲属及100例无亲缘关系的正常对照均未检测到上述突变。结论在该例NF1患儿中新发现1个NF1基因移码突变c.3822delC不是罕见的单核苷酸多态性，可能是致病突变，通过影响NF1基因的功能致病。

神经纤维瘤病1型；基因，神经纤维瘤病1型；突变

目前认为1型神经纤维瘤病（neurofibromatosis type 1，NF1，OMIM：162200）主要是由NF1基因突变所致［1］。本研究通过PCR及DNA测序法检测1例NF1患儿的NF1基因突变情况。

一、病例与方法

1.临床资料：患儿男，2岁；1月龄时躯干部出现咖啡斑，逐渐增大增多。发育欠佳，语言能力较差。皮肤科检查：躯干、四肢未扪及皮下结节，全身遍布咖啡色斑，腋下散在雀斑样痣皮损。诊断：NF1。患儿为散发病例，家族中只有1例患病，患儿父母正常，非近亲婚配，无相同疾病家族史。本研究经过江苏省中医院医学伦理委员会批准，患儿监护人及正常对照者均签署知情同意书。

2.DNA提取：抽取患儿及患儿父母的静脉血3 ml，放置于5 ml EDTA抗凝管中，-80℃储存。采用盐析法提取基因组DNA，质控标准：DNA浓度 ＞ 100 ng/μl，总量 ＞ 5 μg，A260/A280比值范围在1.8～2.0之间。同时提取100例无亲缘关系、门诊确诊无NF1病史的正常人基因组DNA作为对照，以排除基因的多态性。

3.引物设计及PCR扩增：利用（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库获得NF1基因组序列，应用Primer 5.0软件设计NFI基因外显子引物：扩增第28号外显子正向引物5′⁃ATTCAGTATTCGCTGAGTTCC⁃3′；反向引物5′⁃TACCTATTAG CCTCTTTCCCT⁃3′，PCR反应体系为30 μl：ddH2O 16 μl，10 × 缓冲液 3 μl，dNTP 混合物（10 μmol/L）3 μl，MgCl22 μl，引物 F（10 μmol/L）1.5 μl，引物R（10 μmol/L）1.5 μl，Ex Taq 1 μl，模板DNA 2 μl。PCR反应在Biomometra PCR仪（德国Biometra公司）上进行，采用Touchdown反应程序。预变性94℃5 min，变性94℃30 s，退火64℃30 s、延伸72℃60 s，前14个循环每循环退火温度下降0.5℃，14个循环后降至57℃，再以57℃为退火温度进行31个循环，延伸72℃5 min。

4.DNA测序：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证、纯化后测序，用ABI 3130遗传分析仪进行序列分析，通过Chromas V2.23软件比对分析测序数据。用chromas软件（版本2.0）分析基因序列，确定突变位点。

图1 1型神经纤维瘤病（NF1）基因突变 患者NF1基因存在移码突变，即c.3822delC（p.F1275SX10）。对照为患者父亲NF1基因序列。图中箭头所示为突变位点

二、结果

发现1个移码突变，c.3822delC（图1）。扩增cDNA进一步检测，确实发生单碱基缺失导致移码突变。在患儿6例正常的直系家属及100例无血缘关系的正常对照中均未检测到上述突变，证明其不是罕见的单核苷酸多态性（SNP）。

三、讨论

NF1基因的外显率为100%，意味着所有携带NF1突变的患者均会发生NF1。超过92%符合NIH诊断标准的NF1患儿通过广泛的基因测序均能检测到NF1突变［2⁃3］。当成年患者在临床上仅表现为牛奶咖啡斑及腋窝散在雀斑而不伴有神经纤维瘤时，分子检测对于NF1的确诊有帮助。此种符合NF1诊断标准具有轻微的显型患者可能是Legius综合征，其突变基因为SPRED1［4］。Leguis综合征不会出现神经纤维瘤及眼部Lisch结节。相似的症状源于两者不同的受累基因编码同一反应通路的蛋白，缺乏肿瘤生长是二者很重要的不同点。约2%临床符合NF1诊断标准的患者实际上包含SPRED1突变［5］，意味着有必要对临床高度怀疑或者确诊为NF1的患者进行NF1及SPRED1基因筛查，作为确诊NF1的必要条件。因为二者的预后不同，临床的随访程度会有相应的差别。

目前NF1基因已报道1 382个突变，包括错义突变、无义突变、剪切突变、插入突变、缺失突变及重复片段等多种类型。其中插入、缺失导致的移码突变占所有突变类型的54%，剪切突变占21%。说明本病主要是由于NF1基因突变后单倍体效应不足所致［6］。本文结果发现1个移码突变，第28号外显子c.3822delC，第1275位氨基酸之后10位提前形成终止密码子，很可能对蛋白质的结构和功能产生较大影响。该突变位点既往未见报道，为NF1新的突变位点。NF1基因具有较高的突变频率。据统计，接近一半的患者发生的突变为自身新发突变，无家族遗传史［7］。散发的种系NF1基因突变表现出性别偏倚，大多数（＞80%）的新突变是父系来源的，而大多数所谓的染色体微缺失似乎是母系来源的［8］。染色体微缺失包括整个NF1基因及其翼区。目前仅有2种NF1基因关于基因型和表现型的关系是已知的：1种是NF1基因染色体微缺失，可导致严重的1型神经纤维瘤病，表现为更高的神经纤维瘤风险，躯体形态异常及学习障碍；第2种为17外显子3⁃bp的框内缺失，多数患者表现为较轻的临床症状，伴有NF1典型的色素沉着特征（牛奶咖啡斑、腋窝及腹股沟雀斑）和Lisch结节，但并不会进展出皮肤或临床可检测出的从状神经纤维瘤［8］。除了生殖细胞发生的种系突变外，NF1还存在体细胞的突变，导致患者出现“镶嵌现象”（节段型1型神经纤维瘤病）或局限于身体某一部位的1型神经纤维瘤病。

本研究发现的突变丰富了NF1突变谱，为疾病的机制研究和基因型与表现型关系的研究提供了一定的依据，并为进行遗传咨询及产前诊断提供了一定的帮助。

［1］Ahlawat S,Fayad LM,Khan MS,et al.Current whole⁃body MRI applications in the neurofibromatoses:NF1,NF2,and schwanno⁃matosis［J］.Neurology,2016,87（7 Suppl 1）:S31 ⁃39.DOI:10.1212/WNL.0000000000002929.

［2］Ahlawat S,Fayad LM,Khan MS,et al.Current whole⁃body MRI applications in the neurofibromatoses:NF1,NF2,and schwanno⁃matosis［J］.Neurology,2016,87（7 Suppl 1）:S31 ⁃39.DOI:10.1212/WNL.0000000000002929.

［3］Messiaen L,Callens T,Mortier G,et al.Exhaustive mutation analysis of the NF1gene allows identification of 95%of mutations and reveals a highfrequency of unusual splicing defects.Hum Mutat 2000,15（6）:541⁃555.DOI:10.1002/1098⁃1004（200006）15:6＜541::AID⁃HUMU6＞3.0.CO;2⁃N.

［4］Brems H,Chmara M,Sahbatou M,et al.Germline loss⁃of⁃function mutations in SPRED1 cause a neurofibromatosis 1⁃like phenotype［J］.NatGenet,2007,39（9）:1120⁃1126.DOI:10.1038/ng2113.

［5］Messiaen L,Yao S,Brems H,et al.Clinical and mutational spectrum of neurofibromatosis type 1⁃like syndrome［J］.JAMA,2009,302（19）:2111⁃2118.DOI:10.1001/jama.2009.1663.

［6］Brems H,Beert E,de Ravel T,et al.Mechanisms in the pathogenesis of malignant tumours in neurofibromatosis type 1［J］.Lancet Oncol,2009,10（5）:508⁃515.DOI:http://dx.doi.org/10.1016/S1470⁃2045（09）70033⁃6.

［7］Beert E,Brems H,Renard M,et al.Biallelic inactivation of NF1 in a sporadic plexiformneurofibroma［J］.Genes Chromosomes Cancer,2012,51（9）:852⁃857.DOI:10.1002/gcc.21969.

［8］Jouhilahti EM,Peltonen S,Heape AM,et al.The pathoetiology of neurofibromatosis 1［J］.Am J Pathol,2011,178（5）:1932⁃1939.DOI:10.1016/j.ajpath.2010.12.056.

Mutation detection of NF1 gene in a patient with neurofibromatosis type 1

Ji Jin,Guo Qin,Zhang Ruohua,Li Ming

Department of Dermatology,Jiangsu Province Hospital of TCM,Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM,Nanjing 210023,China（Ji J,Guo Q,Zhang RH）;Department of Dermatology,Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Nanjing 200092,China（Li M）

Li Ming,Email:aypyslm@163.com

ObjectiveTo detect NF1 gene mutations in a patient with neurofibromatosis type 1（NF1）.MethodsPolymerase chain reaction（PCR）and DNA sequencing were performed to detect mutations of the NF1 gene in a patient with NF1,his parents and 100 unrelated healthy controls.ResultsA novel frameshift mutation（c.3822delC）was identified in the patient,but not found in his parents or the unrelated healthy controls.ConclusionThe novel frameshift mutation（c.3822delC）found in the patient is not a rare single nucleotide polymorphism（SNP）,and may be a causative mutation for NF1 by affecting the function of the NF1 gene.

Neurofibromatosis 1;Genes,neurofibromatosis 1;Mutation

李明，Email：aypyslm@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.06.013

2016⁃06⁃22）

（本文编辑：颜艳）