“柳城05136号”甘蔗脱毒培养

黄勇，张铁，刘伟

（云南省文山学院，云南文山663099）

“柳城05136号”甘蔗脱毒培养

黄勇，张铁，刘伟

（云南省文山学院，云南文山663099）

以“柳城05136号”甘蔗为材料，通过预处理与脱毒培养，旨在建立起“柳城05136号”甘蔗健康种苗繁育体系。结果表明：经预处理，茎段腋芽萌发率达94%。茎尖在MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+AC 3.0g/L培养基中生长良好。在增殖培养基MS+6-BA 2.0mg/L+KT 0.5mg/L中增殖系数达15.2。在生根培养基MS+NAA 1.0mg/L中，生根率达95%。经炼苗移栽存活率为92%。由此，建立了“柳城05136号”甘蔗健康种苗繁育体系，丰富了甘蔗健康种苗生物多样性。

甘蔗；“柳城05136号”；脱毒培养

甘蔗 （Saccharum officinarumLinn） 为禾本科（Gramineae）甘蔗属（Saccharum）植物，我国南方热带地区广泛种植[1]。由于长期无性繁殖，病毒病严重危害，导致甘蔗品种退化、产量下降、品质变劣。采用传统的物理、化学及生物等方法来防治病毒病收效甚微。热处理可钝化病毒，茎尖培养更是生产无病毒种苗的有效途径[2]。将两者结合起来可以除去甘蔗花叶病、宿根矮化病等病害，生产健康种苗[3-8]。巴西、古巴、美国、澳大利亚等世界甘蔗生产大国蔗区均使用健康种苗。如巴西使用甘蔗健康种苗，产量提高20%～40%，含糖量提高0.5%以上[9]。健康种苗对甘蔗产业发展至关重要，而我国在甘蔗生产上只有少数地区使用健康种苗，而且品种单一，仅有脱毒“新台糖22号”。有关“柳城05136号”健康种苗的研究国内外鲜见报道。本试验通过对“柳城05136号”进行预处理和脱毒培养，希望建立“柳城05136号”甘蔗健康种苗繁育体系，丰富健康种苗的多样性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

将“柳城05136号”甘蔗切成带腋芽的茎段作为试验材料。

1.2 材料预处理

1.2.1 温汤浸种

甘蔗茎段放入50℃恒温水浴锅中温汤浸种15min。

1.2.2 恒温培养

恒温培养箱中放置育苗盘，育苗盘上平铺一层湿润的毛巾。甘蔗茎段两端蘸取杀菌剂后横放在湿毛巾上。腋芽生长点朝上，如图1所示。茎段上方再平铺一层湿毛巾。培养温度为35℃、相对湿度为80%、光照强度为1000lx，观察腋芽萌发情况。

图1 甘蔗腋芽培养方式

1.2.3 消毒处理

待甘蔗茎段腋芽萌发后即揭掉上层湿润毛巾。腋芽长到2cm左右时，将腋芽带少量茎切下进行消毒。75%酒精消毒1min后用无菌水冲洗3次。0.1%HgCl2消毒25 min后用无菌水冲洗5次。

1.3 脱毒培养

1.3.1 茎尖生长

剥取茎尖接种到以MS为基本培养基、6-BA（0.5、1.0、2.0、4.0mg/L）、2,4-D（0.5、1.0、2.0、4.0mg/L）、AC 3.0g/L、蔗糖（30g/L）、琼脂（7g/L）的茎尖生长培养基上。共16个处理，每处理接种8瓶，每瓶接种5个茎尖。培养条件为温度25℃、光照强度2000lx，观察茎尖生长情况。

1.3.2 增殖培养

等到茎尖长到3cm左右时，转到增殖培养基中培养。增殖培养基以MS为基本培养基，附加6-BA（1.0、2.0、3.0、4.0mg/L），KT （0.1、0.2、0.5、1.0mg/L）， 蔗 糖（30g/L），琼脂（7g/L）。共16个处理，每个处理接种12瓶，每瓶接种3个外植体。培养条件为温度28℃、光照强度3000lx。观察生长情况。对试验数据进行极差分析，并用SPSS软件进行统计分析[10]。

1.3.3 生根培养

无根苗转到以 MS为基本培养基、NAA（0.5、1.0、2.0、4.0mg/L）、蔗糖（30g/L）、琼脂（7g/L）的生根培养基中进行培养。共4个处理，每个处理接种5瓶，每瓶接种8棵无根苗。培养在温度为25℃，光照强度为2000lx条件下，观察生根情况。

1.4 炼苗移栽

将甘蔗苗移至室外阴凉处放置1d，拧松瓶盖放置1d，揭除瓶盖放置1d。取出甘蔗苗，将附着在根部的培养基洗净，杀菌剂消毒，种植在温室中。

初期应设置遮阳网，防止暴晒。到中期时撤除遮阳网。加强温度、水分、营养管理，使甘蔗种苗逐步适应自然条件。

1.5 病害检测

参照李利君等（2000）[11]和 Clyn James（1997）[12]的方法对“柳城05136号”甘蔗种苗进行花叶病和宿根矮化病的检测。

2 结果与分析

2.1 腋芽萌发

通过温汤浸种与恒温培养，“柳城05136号”甘蔗腋芽萌发率为94%，到7d左右时生长到2cm左右。如图2所示。此法打破腋芽休眠，不受季节限制，可随时取材进行甘蔗脱毒培养。

图2 预处理后腋芽萌发情况

2.2 茎尖生长情况

在不同6-BA与2,4-D浓度组合的培养基中，茎尖生长情况有所不同。其中，在MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+AC 3.0g/L中，茎尖的生长速度快、畸形苗少，是较适宜的茎尖生长培养基，如图3所示。当6-BA和2,4-D的浓度过高时畸形苗多，且形成大量愈伤组织，茎尖无法正常生长；浓度过低茎尖生长慢或不生长。

图3 在适宜培养基中甘蔗茎尖生长情况

2.3 增殖系数

在不同的增殖培养基中，增殖系数高低不一。对其进行极差分析，结果如表1所示。

从表 1 可以看出，对于 6-BA 来说，k2＞k3＞k1＞k4，即当6-BA浓度为2.0mg/L时增殖系数最高，平均为11.7。对于 KT来说，k3＞k2=k4＞k1，即当 KT浓度为 0.5mg/L时增殖系数最高，平均为9.6。从极差R来看，6-BA＞KT，说明6-BA对甘蔗增殖系数的影响大于KT。处理7最优，即“柳城05136号”甘蔗在增殖培养基MS+6-BA 2.0mg/L+KT0.5mg/L中增殖系数最高，达15.2。

用SPSS软件对甘蔗增殖情况进行统计分析，结果如表2所示。

从表2可以看出，6-BA和KT对“柳城05136号”甘蔗增殖系数均有极显著的影响，且二者之间还存在极显著的交互作用。说明适宜浓度的6-BA和KT搭配使用，对“柳城05136号”甘蔗的增殖起着至关重要的作用。

2.4 生根情况

无根苗在不同的生根培养基中生长情况有差异。其中，在MS+NAA1.0mg/L中，生根率最高，达95%，且根多而长，如图4所示。

图4 甘蔗在适宜培养基中生根情况

2.5 移栽存活率

炼苗移栽后，“柳城05136号”甘蔗种苗生长正常，存活率达92%。

2.6 病害检测结果

经检测，种苗脱去了花叶病和宿根矮化病，从而繁育出“柳城05136号”甘蔗健康种苗。由于在培养的植株中许多病毒具有延迟的恢复期，所以在最初18个月中每隔一定时间需进行鉴定。而且无病毒植株容易再被感染，因此在繁殖的不同时期仍需重复进行鉴定。只有对待定的病毒显示持续阴性反应的无病毒植株才能进一步扩大繁殖[2]。“柳城05136号”甘蔗健康种苗在田间是否具有抗花叶病和宿根矮化病特性有待进一步的大田试验。

3 讨论

世界甘蔗生产大国在生产上已普遍使用健康种苗，而我国只有部分地区使用健康种苗，而且品种比较单一，对我国甘蔗产业可持续发展不利。本试验通过材料预处理与脱毒培养，建立了“柳城05136号”甘蔗健康种苗的繁育体系，丰富了甘蔗健康种苗的生物多样性。在生产中是否始终具有花叶病与宿根矮化病抗性，是否能发挥甘蔗健康种苗高产、高糖的“双高”优势，有待进一步的大田试验。

表1 “柳城05136号”甘蔗增殖系数极差分析表

表2 “柳城05136号”甘蔗增殖系数方差分析表因变量：增殖系数

[1]吴征镒.中国植物志[M].北京:科学出版社,1997,10(2):41.

[2]彭星元,余皖苏.植物组织培养技术（第二版）[M].北京:高等教育出版社,2013,1:85-94.

[3]Leu LS.Freeing sugarcane from mosaic virus by apical meristem culture and tissue culture[R].Report Taiwan Sugar Experiment Station,1972,57:57-63.

[4]Hendre RA,Mascarenhas AF,Nadgir AL,et al.Growth ofmosaic virus-free sugarcane plants from apical meristems[R].Indian Pathology,1975,28:185-198.

[5]Waterworth R,Kahn RP.Thermotherapy and aseptic bud culture of sugarcane to facilitate the exchange of germplasm and passage through quarantine[R].Plant Disease Report,1978,62:772-776

[6]Leu LS.Apical meristem culture and redifferentiation of callus masses to free some sugarcane systemic disease[J].Plant Protection Bulletin,1978,20:77-82

[7]杨本鹏,张树珍,杨学,等.甘蔗健康种苗培育体系的建立[J].热带作物学报,2006,(4):74-77.

[8]游建华,樊保宁,韦昌联.甘蔗脱毒健康种苗生产及繁殖技术[J].中国种业,2008(9):50.

[9]Lee TSG.Micropropagation of sugarcane (Saccharum spp.)[J].Plant cell,tissue and organ culture,1991,10:47-55.

[10]方开泰,马长兴.正交与均匀实验设计 [M].北京:科学出版社,2001:35-52.

[11]李利君,周仲驹,谢联辉.利用斑点杂交法和RT-PCR技术检测甘蔗花叶病毒[J].福建农业大学学报,2000,29(3):342-345.

[12]Clyn James.A reviewof ratoon stunting disease[J].Sugar Cane,1997,4:9-14.

Virus-free Culture of Sugarcane"Liucheng No.05136"

HUANG Yong,ZHANG Tie,LIU Wei
(Wenshan University of Yunnan Province,Wenshan 663099,China)

It aimd at building a breeding system of healthy seedling of sugarcane of"Liucheng No.05136"by pretreating and virus-free culture.The result showed that germination rate of lateral bud was 94%after pretreating.Stem tip growed well in the medium of MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+AC 3.0mg/L.Multiplication rate was 15.2 in the subculture medium of MS+6-BA 2.0mg/L+KT 0.5mg/L.Rooting rate was high to 95%in the rooting medium of MS+NAA 1.0mg/L.Survival rate was 92%after acclimatizing and transplanting.A breeding system of healthy seedling for"Liucheng No.05136"was built up.Biodiversity of healthy seedling of sugarcane was enriched.

Sugarcane;"Liucheng No.05136";virus-free culture

S566.1

A

1008-1038(2017)10-0070-04

10.19590/j.cnki.1008-1038.2017.10.021

2017-08-02

云南省教育厅科学研究基金项目（2012Y269）；文山学院科学研究基金项目（13WSY06）；文山州科技计划项目

黄勇（1981—），男，讲师，主要从事植物资源开发工作