大鼠侧脑室注射Nesfatin-1对糖脂代谢的影响及其与下丘脑AMPK表达的关系

秦小云， 李桂成， 张庆金， 蔡科军， 谢正轶， 覃淑云， 朱 琳， 夏春波

大鼠侧脑室注射Nesfatin-1对糖脂代谢的影响及其与下丘脑AMPK表达的关系

秦小云1， 李桂成1， 张庆金1， 蔡科军1， 谢正轶1， 覃淑云1， 朱 琳2， 夏春波2

目的探讨侧脑室注射摄食抑制因子Nesfatin-1对糖脂代谢的影响及其与下丘脑AMPK表达的关系。方法借助脑立体定位技术将Nesfatin-1(1-82)重组蛋白注射至大鼠侧脑室(实验组)，设注射等体积人工脑脊液的假手术组和未施加任何干扰因素的对照组，大鼠继续饲养4 w后，全自动生化分析仪检测血糖血脂水平变化，RT-PCR法检测大鼠下丘脑组织AMPK mRNA表达，Western blotting法检测大鼠下丘脑组织AMPKα及磷酸化AMPKα(pAMPKα)的表达。结果(1)生化检测实验结果显示，实验组大鼠FPG和TG与对照组比较均显著下降(P<0.05)，但TC、HDL和LDL水平未见明显变化(P>0.05)；(2)RT-PCR及Western blotting实验结果显示，与对照组比较，实验组的AMPK mRNA及蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)，假手术组的AMPK mRNA及蛋白表达水平与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。结论Nesfatin-1可能在糖脂代谢神经调节过程中具有重要作用，其机制可能与下丘脑AMPK表达水平有关。

Nesfatin-1； 糖脂代谢； AMPK； 下丘脑

内脏功能受神经系统调节，下丘脑是能量平衡的调节中枢，存在对多种能量改变的感受器，可以接收外周神经、激素及营养的信号，通过交感/副交感神经来调节摄食与能量代谢[1,2]。Nesfatin-1是核组蛋白2(nucleobindin-2，NUCB2)N端由82个氨基酸组成的肽段，在摄食、肥胖和能量代谢调节过程中具有重要作用[3]。腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)在真核细胞中广泛存在，大量证据表明存在于下丘脑区域的AMPK介导着摄食及能量调节的信号分子作用，但AMPK与Nesfatin-1之间的关系尚未清楚。

为阐明脑内Nesfatin-1在糖脂代谢调节中的作用及其与下丘脑AMPK的关系，本研究拟借助脑立体定位技术将Nesfatin-1注射至大鼠侧脑,检测血糖血脂水平变化以及下丘脑AMPK表达水平;探讨Nesfatin-1调节糖脂代谢的下丘脑机制;为糖脂代谢神经调节机制的深入研究提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要仪器和实验试剂 脑立体定位仪(日本SR-6)，全自动生化分析仪(德国Erba XL-600)，荧光定量PCR仪(美国ABI)，凝胶成像系统(美国BIO-RAD)，微量进样器(上海高鸽)。大鼠Nesfatin-1购自 Phoneix公司，血糖血脂试剂盒购自桂林优利特公司，BCA试剂盒购自北京雷根公司，蛋白Marker购自Fermentas公司，HRP标记的山羊抗小鼠IgG和电化学发光(ECL)试剂盒均购自中杉金桥公司。AMPK抗体购自proteintech公司，荧光定量PCR试剂盒购自Solarbio公司。

1.2 实验动物及分组 雄性Spraque-Dawley(SD)大鼠45只，体重250～300 g，随机分为实验组、假手术组和正常对照组，均由桂林医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK桂2007-0001。实验组(n=15)参照大鼠脑立体定位图谱，经10%水合氯醛麻醉(4 ml/kg，腹腔注射)后固定在脑立体定位仪上，参照文献[4]进行侧脑室置管和注射Nesfatin-1(0.25 μg/h，持续6 h)，注射坐标(前囟后1.2 mm、右侧旁开2.0 mm、进针3.6 mm)。假手术组(n=15)注射等体积的人工脑脊液(NaCl 126 mmol/L；CaCl22.0 mmol/L；H2O 2.0 mmol/L；MgCl23.5 mmol/L；MgSO41.0 mmol/L；NaHCO326.0 mmol/L；NaH2PO41.25 mmol/L；葡萄糖10.0 mmol/L；pH 7.35～7.45)。对照组(n=15)未施加任何干扰因素。

1.3 大鼠血糖血脂水平检测和组织标本处理 大鼠右侧侧脑室注射Nesfatin-1后继续饲养4 w，先行水合氯醛麻醉，将大鼠固定后用1 ml注射器在大鼠胸骨左缘心脏搏动最强点垂直进针进行心脏采血，分离血浆，应用全自动生化分析仪检测大鼠空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL)。心脏采血后立即断头取脑，剥开颅骨，分离下丘脑，置于液氮中保存备用。

1.4 RT-PCR法检测大鼠下丘脑组织AMPK mRNA表达 在液氮中将下丘脑组织研磨成粉末，采用Trizol法提取组织总RNA，依次加入氯仿、异丙醇使RNA沉淀，经洗涤后加入无RNase水溶解，测完浓度后备用。将RNA逆转录成cDNA，以此为模板荧光定量PCR 法检测各组样本的AMPK mRNA表达水平。反应条件为预变性95 ℃，10 min；变性95 ℃，15 s，退火58 ℃，25 s，延伸72 ℃，30 s，进行40个循环。每个样本设立3个平行孔，另行溶解曲线分析，证明无非特异性扩增。通过软件分析得到各组样品的CT 值，以2-ΔΔ CT值表示各组的相对表达量。AMPK(110 bp)上游引物5’-TCTGAGGGGCACCAAGAAAC-3’，下游引物5’-GTGGGTGTTGACGGAGAAGAG-3’；内参β-actin(150 bp)上游引物5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游引物5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’。

1.5 Western blotting法检测大鼠下丘脑组织AMPKα及磷酸化AMPKα(pAMPKα)的表达水平 在液氮中将下丘脑组织研磨成粉末，每20 mg组织加100微升裂解液。BCA试剂盒检测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜条件为90 mA，1.5 h，将PVDF膜放入AMPK一抗中，4 ℃过夜，加二抗，室温孵育1 h。按照ECL发光试剂盒说明书，使PVDF膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影，凝胶成像分析系统对蛋白条带光密度测定并分析。AMPK蛋白的灰度值除以内参基因β-actin的灰度值，所得比值代表样品中AMPK蛋白的相对含量。

2 结 果

2.1 大鼠血糖血脂水平 大鼠右侧侧脑室注射Nesfatin-1(1-82)重组蛋白，继续饲养4 w后，全自动生化分析仪检测结果显示，实验组大鼠FPG和TG与对照组比较均显著下降(P<0.05)，但TC、HDL和LDL水平未见明显变化(P>0.05)，假手术组与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)(见表1)。

2.2 大鼠下丘脑组织AMPK表达水平 大鼠右侧侧脑室注射Nesfatin-1(1-82)重组蛋白4 w后，采用荧光定量PCR法对大鼠下丘脑组织进行了PCR扩增，AMPK基因融解曲线显示为单一锐峰，未见非特异性产物，与对照组比较，实验组的AMPK mRNA表达水平明显降低(P<0.05)(见图1)。Western blotting实验结果显示，AMPKα亚基大小为63 kD，与对照组比较，实验组AMPKα和pAMPKα表达水平均明显降低(P<0.05)(见图2、图3)。假手术组的AMPK mRNA及蛋白表达水平与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。

表1 各组大鼠血糖血脂水平

与对照组比较*P<0.05

图1 大鼠下丘脑组织AMPK mRNA表达

图2 大鼠下丘脑组织AMPK蛋白表达

图3 大鼠下丘脑组织AMPK蛋白表达水平结果分析

3 讨 论

糖脂代谢受神经系统的整体调节，是目前国内外研究的热点之一[5～7]，比如，低血糖时，可通过增加内脏交感神经活性使肝糖生成增多，而胰岛素分泌减少，胰高血糖素分泌增多[8]。近年来，下丘脑对内脏功能的调节一直受到关注[9]，中枢神经系统可以通过下丘脑- 垂体- 肾上腺皮质轴(HPA轴)来调控外周器官功能活动，老年抑郁症患者HPA轴激素水平升高与脑垂体、肾上腺体积增大有关[10]，大脑海马对HPA轴的调节与下丘脑中的室旁核(PVN)有直接关系，也可通过前脑终纹床核(BNST)等核团来影响PVN活性[11]。

Nesfatin-1是位于NUCB2 N端的肽段，大鼠脑室内输注Nesfatin-1有明显的抑制摄食作用，其中间片段(M30，24-53残基)可能是Nesfatin-1产生摄食抑制作用的关键区域[3]。外周的摄食信号也可导致下丘脑Nesfatin-1表达水平的变化，Nesfatin-1表达升高与进食量减少以及体重降低有关[12]。吴静等[13]通过侧脑室置管的方法，将射1、5和50 pmol的nesfatin-1注射至侧脑室，结果显示，nesfatin-1可呈剂量和时间依赖性的抑制大鼠胃酸分泌，并且组胺信号通路可能参与了上述过程。另有研究[4]显示，中枢Nesfatin-1(1-82)短期灌注可增加了大鼠机体胰岛素敏感性(IS)，并抑制了肝糖异生。本研究利用脑立体定位技术，将Nesfatin-1(1-82)重组蛋白缓慢注射至大鼠侧脑室，4 w后生化检测结果显示，大鼠空腹血糖(FPG)和TG明显降低，TC、HDL和LDL未见明显变化，提示脑内Nesfatin-1可能在糖脂代谢调节中具有重要作用。下丘脑Nesfatin-1调节内脏功能的信号通路，有研究显示，Nesfatin-1基因敲除可增强与mTOR-STAT3信号通路抑制相关的大鼠肝脏糖异生[14]。另有报道，Nesfatin-1可能是通过POMC途径起作用的[3,15]，而可能与瘦素信号传导通路无关[3,16]。AMPK在能量代谢调节中有重要作用，主要在骨骼肌、肝、胰、脂肪组织以及中枢神经系统中表达，其主要作用是根据机体的需要来调节产能及耗能代谢。下丘脑AMPK是各种调控摄食行为信号通路的中介，摄食抑制因素可抑制下丘脑AMPK的活性，进而可减少食物的摄入[17]。

本研究结果显示，侧脑室注射Nesfatin-1引起的血糖血脂水平降低可能与下丘脑AMPK mRNA及蛋白表达水平下降有关，推测下丘脑AMPK与Nesfatin-1调节摄食和能量代谢关系密切，但其确切机制尚需深入研究，如下丘脑信号传导通路以及内脏交感、副交感神经的作用等。另有报道[18]，NUCB2/Nesfatin-1在饮食诱导肥胖(DIO)大鼠下丘脑的表达水平明显降低，其可能在糖脂代谢神经调节中具有重要作用。

综上所述，本研究通过侧脑室注射Nesfatin-1进一步证实了其在糖脂代谢调节中的作用，其机制可能与下丘脑AMPK表达水平有关，阐明这一机制可为摄食与物质代谢的神经调节机制研究提供依据。

[1]Stefanidis A,Wiedmann NM,Adler ES,et al.Hypothalamic control of adipose tissue[J].Best Pract Res Clin Endocrinol Metab,2014,28(5):685-701.

[2]Morgan DA,Mcdaniel LN,Yin T,et al.Regulation of glucose tolerance and sympathetic activity by MC4R signaling in the lateral hypothalamus[J].Diabetes,2015,64(6):1976-1987.

[3]Oh-IS,Shimizu H,Satoh T,et al.Identification of Nesfatin-1 as a satiety molecule in the hypothalamus[J].Nature,2006,443(7112):709-712.

[4]叶 菲,朱 伟,杨刚毅,等.脑室内灌注重组蛋白Nesfatin-1(1-82)对大鼠糖脂代谢和相关酶的影响[J].中国糖尿病杂志,2013,21(6):540-543.

[5]Xia C,Zhu L,Shao W,et al.The Effect of Hippocampal cognitive impairment and XIAP on glucose and lipids metabolism in rats[J].Cell Physiol Biochem,2016,38(2):609-618.

[6]Farr S,Taher J,Adeli K.Central nervous system regulation of intestinal lipid and lipoprotein metabolism[J].Curr Opin Lipidol,2016,27(1):1-7.

[7]Folgueira C,Beiroa D,Callon A,et al.Uroguanylin action in the brain reduces weight gain in obese mice via different efferent autonomic pathways[J].Diabetes,2016,65(2):421-432.

[8]Stockhorst U,Steingraber HJ,Scherbaum WA.Classically conditioned responses following repeated insulin and glucose administration in humans[J].Behav Brain Res,2000,110(1/2):143-159.

[9]Bouret SG,Draper SJ,Simerly RB.Trophic action of leptin on hypothalamic neurons that regulate feeding[J].Science,2004,304(5667):108-110.

[10]李 卓,张海三,李 杰,等.老年抑郁症患者下丘脑-垂体-肾上腺轴功能和垂体、肾上腺体积的变化[J].实用医学杂志,2016,32(14):2329-2332.

[11]Mueller NK,Dolgas CM,Herman JP.Stressor-selective role of the ventral subiculum in regulation of neuroendocrine stress responses[J].Endocrinology,2004,145(8):3763-3768.

[12]吴 博,刘重斌,董缪武,等.重复性饥饿/再投喂对大鼠下丘脑NUCB 2表达影响[J].中国公共卫生,2010,26(3):313-314.

[13]吴 静,贾方圆,谢碧云,等.侧脑室注射nesfatin-1 抑制大鼠胃酸分泌[J].基础医学与临床,2013,33(5):552-556.

[14]Wu D,Yang M,Chen Y,et al.Hypothalamic nesfatin-1/NUCB2 knockdown augments hepatic glucon eogenesis that is correlated with inhibition of mTOR-STAT3 signaling pathway in rats[J].Diabetes,2014,63(4):1234-1247.

[15]Shimizu H,Oh iS,Hashimoto K,et al.Peripheral administration of Nesfatin-1 reduces food intake in mice:the leptin-independent mechanism[J].Endocrinology,2009,150(2):662-671.

[16]Stengel A,Goebel M,Tache Y.Nesfatin-1:a novel inhibitory regulator of food intake and body weight[J].Obes Rev,2011,12(4):261-271.

[17]Lee WJ,Song KH,Koh EH,et al.Alpha-lipoic acid increases insulin sensitivity by activating AMPK in skeletal muscle[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,332(3):885-891.

[18]秦小云,王伯钧,伍善广,等.NUCB2/Nesfatin-1 在DIO 大鼠下丘脑中的表达[J].中国临床解剖学杂志,2014,32(6):704-707.

TheeffectofinjectingNesfatin-1intoLateralventricleonglucolipidmetabolismanditsconnectionwithAMPKexpressionofhypothalamusinrats

QINXiaoyun,LIGuicheng,ZHANGQingjin,etal.

(DepartmentofAnatomy,SchoolofMedical,TechnologyandScienceofGuangxiUniversity,Liuzhou545006,China)

ObjectiveTo investigate the effect of injecting the feeding inhibitory factor Nesfatin-1 into Lateral ventricle on glucolipid metabolism and its connection with AMPK expression of hypothalamus in rats.MethodsWith the help of the brain stereotaxic instrument,Nesfatin-1(1-82) recombinant protein (experimental group) and equal artificial cerebrospinal fluid (sham-operated group) were injected into the lateral ventricle of rats,the control group did not exert any interference.4 weeks later,testing the level of blood glucolipid by automatic biochemical analyzer and detecting the expression of AMPK mRNA,AMPKα and pAMPKα in hypothalamus through RT-PCR and Western blotting.Results(1)According to the results of biochemical tests,compared to the control group,the level of FPG and TG in experimental group were significantly decreased (P<0.05),while the level of TC,HDL and LDL were not significant change (P>0.05);(2)According to the results of RT-PCR and Western blotting,compared to control group,the expression of AMPK mRNA and protein level in experimental group were significantly lower (P<0.05) and shown no significant difference (P>0.05) with sham-operated group.ConclusionNesfatin-1 may play an important role in the process of neuroregulation on glucolipid metabolism,the mechanism may be related to the AMPK expression level of hypothalamus.

Nesfatin-1; Glycolipid metabolism; AMP-activated protein kinase; Hypothalamus

R742

A

1003-2754(2017)10-0901-04

2017-08-10；

2017-10-05

广西自然科学基金项目(No.2015GXNSFAA414002)；广西脑与认知神经科学重点实验室自主研究课题(No.16-380-63)；国家自然科学基金项目(No.81260137)

(1.广西科技大学医学院人体解剖学教研室，广西 柳州 545005；2.桂林医学院人体解剖学教研室，广西 桂林 541004)

夏春波，E-mail：xiachunbo910@163.com