胰岛素信号转导通路相关蛋白在肺气肿患者肺组织中的表达*

豆亚伟，王宏涛，田 伟，朱建飞，戴 云，罗向晖，陈耀华

陕西省人民医院(西安710068)

胰岛素信号转导通路相关蛋白在肺气肿患者肺组织中的表达*

豆亚伟，王宏涛，田 伟，朱建飞，戴 云，罗向晖，陈耀华

陕西省人民医院(西安710068)

目的：研究胰岛素治疗对慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺组织的作用机制。方法：择期行肺减容手术患者99例，术前2周开始即给予极化液(含胰岛素液)治疗。术中取肺减容切除肺组织，Western blot 印迹法检测肺组织蛋白激酶B(Akt)、p38丝裂原活化蛋白激酶(P38-MAPK)、核转录因子-κB(NF-κB)表达的变化。结果：胰岛素治疗后肺气肿患者肺组织内磷酸化蛋白激酶B(pAkt)表达水平较其对照组增加(P<0.05)。胰岛素治疗后肺气肿患者肺组织内P38-MAPK表达与其对照组比较无统计学差异(P>0.05)。胰岛素治疗后肺气肿患者肺组织内NF-κB表达较其对照组增加(P<0.05)。结论：胰岛素可能通过在COPD患者的肺组织中激活PI3/Akt信号转导途径并激活其下游的转录因子NF-κB 抑制多种刺激所诱发的细胞凋亡。

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以进行性不完全可逆的气道呼吸气流受限为特征的疾病，有较高的病死率和致残率，在人群中发病率极高[1-2]。肺泡壁细胞凋亡是肺气肿发病机制的一个重要环节。而既往研究已证明胰岛素治疗可明显降低危重症患者在临床上出现的相关并发症的发生率与病死率，并能改善患者的预后，但其中的相关作用机制有待进一步阐明。本研究从肺气肿患者术前2周开始即给予极化液(含胰岛素液)，观察胰岛素治疗对COPD患者肺组织的作用机制。

资料与方法

1 一般资料 选择2013年1月至2016年12月收住本院胸外科并择期行肺减容手术的患者99例，男57例，女42例。99例患者随机分为两组，胰岛素治疗组(IT组)52例，常规治疗组(RT组)47例。IT组男30例，女22例，平均年龄(56.12±13.71)岁，平均体重(70.18±15.38)kg；RT组男27例，女20例，平均年龄(59.28±11.35)岁，平均体重(65.89±12.76)kg。排除标准：术前存在肝肾疾病及其功能不全者；术前凝血功能异常者；二次手术者；既往有糖尿病史者。

2 研究方法 ①胰岛素治疗：用普通胰岛素20 U和10%氯化钾15 ml加入10%葡萄糖液500 ml和50%葡萄糖60 ml配制极化液，术前2周开始给予IT组患者静脉滴注，1次/d，直至手术前1天结束输注。②肺组织蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(pAkt)、p38丝裂原活化蛋白激酶(P38-MAPK)、核转录因子-κB(NF-κB)的 Western blot 印迹法检测：于术中取肺减容切除的肺组织约2 g，用0.9%生理盐水洗净血液，立即置入液氮中备用。标本收集完备后，用Heidolph DIA900组织匀浆器将其匀浆，离心(14 000 g，15 min)后提取其中的组织蛋白。用BCA蛋白定量试剂盒(Pierce)定量蛋白浓度。SDS/PGEA电泳分离蛋白，半干电转法转移到PVDF。5%脱脂乳封闭背景，以抗pAkt、抗pP38-MAPK、NF-κB、p65抗体4 ℃过夜，洗膜后以相应二抗室温孵育1 h，免疫检测试剂盒进行荧光检测。再将pAkt或pP38-MAPK印迹膜50 ℃，30 min复印迹，置于洗脱缓冲液中进行原来的一抗解离，用PBST漂洗并重新封闭印迹膜行Akt、P38-MAPK的检测。

结 果

肺组织Akt、pAkt、P38-MAPK、NF-κB表达的变化：见表1。 ①胰岛素治疗后肺气肿肺组织内Akt表达与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。②胰岛素治疗后肺气肿肺组织内pAkt表达较对照组增加(P<0.05)。表明胰岛素可调节肺气肿肺组织内中Akt的活化。③胰岛素治疗后肺气肿肺组织内pP38-MAPK表达与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。表明胰岛素对肺气肿肺组织中P38-MAPK的活化无明显的影响。④胰岛素治疗后肺气肿肺组织内NF-κB表达较对照组增加(P<0.05)。表明胰岛素可上调肺气肿肺组织中NF-κB的表达。

表1 两组肺组织Akt、P38-MAPK、P38-MAPK、NF-κB表达的变化(灰度值)

讨 论

既往研究已证明，胰岛素与其靶细胞膜胰岛素受体结合后启动并发挥它的作用，而胰岛素受体后信号是通过其中的两条主要的转导通道完成的[3]：一条是Ras-丝裂原激活蛋白(MAPK)转导途径；另一条是磷酸肌醇-3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt/PKB)转导途径[4]，该转导通路介导了胰岛素的大部分生物学效应，能够调节葡萄糖的摄取、促进细胞分裂、增生及生存、抗凋亡、激活多个基因的表达等。

本研究中发现胰岛素治疗后肺气肿患者肺组织内pAkt表达较对照组增加(P<0.05)。这表明胰岛素调节了肺气肿肺组织内Akt的活化。而Akt的活化是胰岛素诱导的抗凋亡及促进细胞增殖、细胞生存作用中的关键步骤，这就提示胰岛素在肺组织内通过激活PI3/Akt转导途径发挥其抗凋亡和促进细胞增殖的作用，从而延缓或改善了肺气肿的形成与发展。另外，本研究中胰岛素治疗后肺气肿患者肺组织内NF-κB表达较对照组增加(P<0.05)，表明胰岛素可上调肺气肿肺组织内NF-κB的表达。而PI3K/Akt信号传导通路可活化转录因子NF-κB[5]，其进入细胞核后，可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。同时NF-κ B活化ATM/ATR、DNA-PK，促进细胞DNA损伤的修复[6]。这一结果提示胰岛素在肺组织内通过活化NF-κB发挥其促进细胞增殖，抑制细胞凋亡及促进细胞DNA损伤的修复等作用，而这些可以促进肺组织细胞的增殖，从而修复肺气肿破坏的肺泡壁等。

胰岛素MAPK信号通道由三部分组成，包括：细胞外信号调节激酶(ERK)、JNK和p38激酶途径[7]。其中胰岛素所激活的ERK信号通路与细胞生长存在相关性。另外，胰岛素通过Ras-MAPK传导途径可以激活p38-MAPK，它能促使靶细胞的基因表达，从而导致细胞的生长，以及促使释放一些相关的细胞因子[8-9]。我们的研究中胰岛素治疗后肺气肿患者肺组织内pP38-MAPK表达与对照组相比较无统计学差异(P>0.05)。这可以表明胰岛素对于肺气肿肺组织内P38-MAPK的活化无明显的影响。

总之，胰岛素可能通过在COPD患者的肺组织中激活磷酸肌醇-3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt/PKB)信号转导途径并激活下游转录因子NF-κB来抑制多种刺激所可能诱发的肺组织内细胞凋亡。而PI3K/Akt信号传导通路在COPD的形成和治疗中所可能扮演重要角色，这些还有待进一步的研究。

[1] 王 媛，张华丽，张 勇，等.COPD急性加重期患者血清SAA、PCT、hs-CRP水平变化及意义[J].陕西医学杂志，2015，44(5)：616-617.

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[3] Gatti G，Perrotti A，Reichart D，etal.Glycated hemoglobin and risk of sternal wound infection after isolated coronary surgery [J]. Circ J，2016，81(1)：36-43.

[4] Chen H，Fajol A，Hoene M，etal. PI3K-resistant GSK3 controls adiponectin formation and protects from metabolic syndrome[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2016，113(20)：5754-5759.

[5] Zhang Y，Shi L，Mei H，etal. Inflamed macrophage microvesicles induce insulin resistance in human adipocytes [J]. Nutr Metab (Lond)，2015，12 (1) ：21.

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[9] Foster SA，Malek S. The RAS/MAPK Axis Gets Stressed Out [J]. Mol Cell，2016，64(5)：854-855.

Expressionofinsulinsignaltransductionpathwayassociatedproteininlungtissueofemphysema

Dou Yawei，Wang Hongtao，Tian Wei，et al.

Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Objective：To study the mechanism of insulin therapy on lung tissue in COPD patients. Methods：Select 99 patients underwent elective lung volume reduction surgery，2 weeks before surgery to give polarized solution (including insulin solution) treatment. The expression of Protein kinase B(Akt)，p38 mitogen-activated protein kinase(P38-MAPK)and nuclear factor-κB(NF-κB)in lung tissue were detected by Western blotting. Results：The expression of Phosphorylated protein kinase B(pAkt) in lung tissue of patients with emphysema after insulin therapy was higher than that in control group (P<0.05).The expression of pP38-MAPK in lung tissue in patients with emphysema after insulin treatment was not significantly different from that in control group (P>0.05). The expression of NF-κB in lung tissue of patients with emphysema after insulin therapy was higher than that in control group (P<0.05). Conclusion：Insulin may inhibit cell apoptosis by stimulating a variety of stimuli by activating the PI3K/Akt signaling pathway and activating its downstream transcription factor NF-κB in lung tissue of COPD patients.

Pulmonary emphysema Insulin Apoptosis Mitogen-activated protein kinase phosphatases NF-kappa B

*陕西省自然科学基金资助项目(2013JC2-23)

肺气肿 胰岛素 细胞凋亡 丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 NF-κB

R562.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.026

(收稿：2017-03-15)