丹参酮ⅡA预处理对心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究

马春香，孙 媛，陈晓斌 ，张 蕾

1.陕西省人民医院(西安710068)，2.西安急救中心(西安 710018)，3.陕西省中医医院(西安 710003)

△通讯作者

丹参酮ⅡA预处理对心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究

马春香1，2，孙 媛1，陈晓斌1，张 蕾3△

1.陕西省人民医院(西安710068)，2.西安急救中心(西安 710018)，3.陕西省中医医院(西安 710003)

目的：观察丹参酮ⅡA(TanⅡA)预处理对心肌缺血再灌注损伤后线粒体通透性的影响。方法：使用SD大鼠，在TanⅡA预处理5 d后进行心肌缺血/再灌注损伤造模并检测心肌梗死面积、肌钙蛋白表达，使用酶联免疫吸附法观察线粒体通透性转换孔(MPTP)开放性以及细胞色素C释放情况。结果：TanⅡA预处理能够减轻心肌梗死面积、减少肌钙蛋白表达；抑制MPTP开放以及细胞色素C释放。结论：TanⅡA预处理能够通过抑制MPTP、减少心肌细胞凋亡发挥心肌保护作用。

丹参酮是丹参的有效成分，其中丹参酮ⅡA(TanⅡA)含量最高。TanⅡA被广泛用于心脑血管疾病的治疗；但是其作用机制尚未完全阐明[1]。线粒体是细胞能量主要来源，其功能损伤导致线粒体通透性转换孔(MPTP)开放，引起线粒体膜电位异常、呼吸链中断、ATP生成障碍并引起细胞凋亡，从而最终导致缺血再灌注损伤；也是预处理等许多心肌保护措施的重要作用靶点[2]。因此本实验通过构建大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型，从MPTP开放角度探讨丹参酮ⅡA预处理对心肌缺血/再灌注损伤的保护机制。

材料与方法

1 材 料 ①实验动物：健康雄性SD大鼠，清洁级，共48只；周龄8～12周，重量180～220 g，由西安交通大学动物中心提供。随机分为三组：假手术组(S组)、缺血再灌注(I/R组)、TanⅡA治疗组(A组)，每组16只。②主要试剂：血浆cTnI检测试剂盒、大鼠细胞色素C氧化酶ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)，线粒体提取试剂盒(南通碧云天生物公司)，伊文式蓝、氯化三苯四氮唑(TTC)(美国Sigma公司)，纯化线粒体MPTP检测试剂盒(美国Pierce公司)。

2 实验方法 ①心肌缺血再灌注模型制作：动物称重后用3%苯巴比妥腹腔注射进行麻醉，使用小动物经鼻呼吸面罩辅助呼吸；常规开胸、逐层分离胸膜、心包，于左心耳下缘、肺动脉圆锥水平纵轴上使用尼龙丝线穿圆形塑料套管结扎左冠状动脉前降支；以结扎部位心肌变白、活动减弱以及心电图出现ST段抬高为缺血成功。结扎30 min后，解开丝线恢复再灌180 min，以结扎线下心肌颜色变红、心电图ST段下降二分之一为再灌成功。②动物模型分组以及给药方法：S组开胸后仅左前降支下穿线、套管不做结扎；210 min后取材；I/R组于术前5 d连续灌胃给予生理盐水，1次/d；A组术前5 d连续灌胃20 mg/kg TanⅡA，1次/d，第5天给药1 h。除S组动物外，所有动物建立心肌缺血再灌注模型。③伊文蓝与TTC双染法测定心肌梗死面积：灌注180 min后，颈动脉取血后经颈静脉快速推注2 ml 伊文氏蓝(浓度为2%)，迅速摘取心肌，于纵轴垂直方向由心底向心间将左心室等距离切为6片，厚约2 mm/片；随后将切片置于37 ℃ 水浴下的1%TTC中避光孵育15 min；取出切片以4%甲醛溶液固定1 h并拍照。其中正常心肌染色为蓝色，缺血区域心肌组织为砖红色，而梗死心肌组织为白色；所有切片拍照后使用Photoshop CS 5.0计算各区域面积，其中红白蓝面积和为左心室总面积，红白面积为缺血区面积；白色区域为梗死面积。计算公式如下：缺血区面积(%)=缺血区总面积/左心室区面积×100%，心肌梗死面积(%)=梗死区面积/缺血区总面积×100%。④心肌肌钙蛋白I(cTnI)测定：左颈动脉血1 ml离心15 min后分离取上清，使用ELISA法完成检测。⑤MPTP以及细胞色素C测定：再灌结束后取出新鲜心肌于生理盐水中清洗，分离左心室并研磨、提取新鲜线粒体；采用分光光度法参照MPTP比色法检测试剂盒检测MPTP开放程度；按照说明书步骤采用ELISA法检测细胞色素C水平。

结 果

三组心肌缺血、梗死面积以及cTnI、MPTP开放性、细胞色素C释放测定结果：见表1。S组未见心肌缺血及梗死。与S组相比，I/R组血cTnI表达水平、MPTP吸光度比值(A440)、细胞色素C释放数值明显升高(P<0.05)；而A组心肌梗死、缺血面积以及血cTnI表达水平、MPTP吸光度比值(A440)、细胞色素C释放数值均低于I/R组(P<0.05)。

表1 三组心肌缺血、梗死面积以及cTnI、MPTP开放性、细胞色素C释放测定结果

注：与S相比，*P<0.05；与I/R组相比，△P<0.05

讨 论

本研究发现，连续5 d的TanⅡA预处理能够通过抑制线粒体通透性、减少cTnI生成，减少细胞色素C释放，从而减少缺血再灌注损伤损伤，发挥心肌保护作用。缺血性心脏病已经成为包括我国在内的全世界最主要死亡原因之一[3]。心肌缺血后再灌恢复可以减少心肌的坏死并改善心功能，但是再灌往往能引起心肌细胞的进一步损伤甚至死亡，从而使心肌梗死面积增加，导致缺血/再灌注损伤。丹参作为我国传统活血化瘀的中药，被广泛用于心血管疾病的治疗；但是其作用机理尚未阐明。TanⅡA是丹参的有效成分之一，已经被大量研究证明具有调节血脂、抗血栓、延缓动脉粥样硬化等作用，也被用于心梗、卒中等血管疾病的临床治疗[4-5]。除了在心肌梗死后发挥治疗作用以外，TanⅡA预处理也同样能够发挥心肌保护作用[6]。

已有研究发现，TanⅡA可以通过丝裂原活化蛋白激酶MAPK以及Ras-PI3K/Akt信号通路上调一氧化氮(NO)释放并减少活性氧(ROS)生成，从而发挥抗氧化、抗炎以及抗凋亡作用并减轻心肌缺血再灌注损伤；但是其作用机制并未完全明确[7]。位于线粒体内膜的转换孔过度开放导致线粒体通透性异常，与心肌缺血/再灌注损伤密切相关。细胞内事件如氧化应激、离子失衡等都会引起线粒体渗透性转换孔的开放，而且其开放程度与外界刺激程度相关并决定了对线粒体功能的影响：当心肌细胞受到严重的刺激事件如缺血再灌注时，MPTP会持续、不可逆的开放，导致线粒体去极化、大量离子进入；使线粒体内外离子失衡，基质水肿、外膜破裂，细胞色素C被大量释放至细胞质中，激活线粒体依赖的凋亡信号、介导细胞死亡。因此，调节MPTP开放能够有效维持线粒体功能，进而减少细胞凋亡，发挥心肌保护作用[8]。以往研究发现，缺血预处理、吸入麻醉药如异氟烷等预处理等都能够减少MPTP开放，抑制线粒体通透性，从而减少细胞色素C释放、抑制凋亡信号通路，发挥心肌保护作用[9]。而在本实验中，TanⅡA预处理同样抑制了缺血再灌注所致MPTP的过度开放，从而保护了线粒体膜的完整性并减少了细胞色素C的释放，减轻了心肌梗死程度。

综上所述，MPTP过度开放在心肌缺血/再灌注损伤过程中发挥着促凋亡的作用；而TanⅡA预处理可以通过抑制MPTP过度开放、减少细胞色素C释放从而减轻心肌细胞凋亡，实现心肌保护作用，为使用TanⅡA预防心肌梗死提供了部分理论依据。但是TanⅡA调节MPTP的上游机制以及是否通过其他信号通路发挥心肌保护作用还需要深入研究。

[1] 李瑞环，王 玲. 丹参酮 ⅡA 的药理研究进展[J].现代中西医结合杂志，2006，15(23)：3303-3305.

[2] Ertracht O，Malka A，Atar S，etal.The mitochondria as a target for cardioprotection in acute myocardial ischemia[J]. Pharmacology & Therapeutics，2014，142(1)：33-40.

[3] Li J，Li X，Wang Q，etal. ST-segment elevation myocardial infarction in China from 2001 to 2011 (the China PEACE-Retrospective Acute Myocardial Infarction Study): a retrospective analysis of hospital data[J]. The Lancet，2015，385(9966): 441-451.

[4] 周如君，李少辉.丹参酮治疗老年冠心病及对血脂和血清 tPA PAI水平的影响[J].陕西中医，2014，35(12)：1606-1608.

[5] 裴 星，陈 刚.丹参酮ⅡA磺酸钠配合西药治疗不稳定型心绞痛36例[J].陕西中医，2009，30(10)：1276-1278.

[6] 戴宁凰，陈 伟，郑中锋，等.丹参酮ⅡA后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究[J].中国心血管病研究杂志，2013 (7): 549-551.

[7] Zhang Y，Zhang L，Chu W，etal.Tanshinone IIA inhibits miR-1 expression through p38 MAPK signal pathway in post-infarction rat cardiomyocytes[J]. Cellular Physiology and Biochemistry，2011，26(6)：991-998.

[8] Hausenloy DJ，Yellon DM.Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target[J]. The Journal of Clinical Investigation，2013，123(1): 92-100.

[9] Agarwal B，Stowe DF，Dash RK，etal.Mitochondrial targets for volatile anesthetics against cardiac ischemia-reperfusion injury[J]. Frontiers in Physiology，2014，5: 341.

(收稿：2017-04-10)

心肌缺血 心肌再灌注损伤 丹参酮ⅡA 缺血预处理，心肌

R541.4

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.014