Nrf2及P62在卵巢癌组织中的表达及临床意义*

李亚玲，王丰艳，李 欢，王宝玲

西安市第四医院(西安710004)

△通讯作者

Nrf2及P62在卵巢癌组织中的表达及临床意义*

李亚玲，王丰艳，李 欢△，王宝玲

西安市第四医院(西安710004)

目的：探讨Nrf2及P62在卵巢癌及相应的正常组织中的阳性表达情况，为卵巢恶性肿瘤恶性程度及预后的判断提供理论参考。方法：收集70例卵巢癌组织及正常组织，采用RT-PCR检测组织中Nrf2 mRNA与P62 mRNA的表达情况；免疫组化法检测组织中P62和Nrf2蛋白的表达情况。结果：在卵巢癌组织中，Nrf2与P62蛋白及mRNA的表达量均明显高于正常组织(P<0.05)。Nrf2 蛋白阳性表达和肿瘤的MDACC分型(P=0.003)、IFGO分期(P=0.036)、大网膜转移(P=0.036)密切相关；而P62蛋白的阳性表达和MDACC分型(P=0.008)、组织学分级(P=0.021)、IFGO分期 (P=0.018)相关。Nrf2和P62的表达在卵巢癌组织中呈明显的相关性(r=0.274，P<0.05)。而Nrf2+/P62+分组中位生存时间28个月，相较于其他分组的患者预后更差。结论：Nrf2和P62的异常表达与卵巢癌的进展密切相关，两者在卵巢癌的发生发展中存在协同作用，Nrf2和P62的共表达往往预示着卵巢癌患者的不良预后。

NF-E2相关因子2(Nrf2)是一种高度保守的关键性核转录因子，对细胞内氧化还原状态非常敏感，并发挥着保护细胞内环境稳定的作用[1]。P62是一种的自噬底物连接蛋白，当自噬发生时它可以与多种待降解蛋白结合，形成复合体并将其运送至自噬小体，进一步与溶酶体结合而被降解[2-5]。本课题初步探讨卵巢癌组织中Nrf2及P62的表达及其与临床病理特征之间的联系。

资料与方法

1 一般资料 选取2010年11月至2011年12月间我院确诊的卵巢癌患者70例，所有患者术前均未接受任何治疗，年龄 29～72 岁，中位年龄 51.7 岁；组织学类型：浆液性囊腺癌48例，子宫内膜样腺癌10例，粘液性囊腺癌12例；FIGO分期：I、II期33例，III、IV期37例；淋巴结转移40例，无淋巴结转移30例。对照组取自同期70例正常卵巢组织(子宫肌瘤、子宫腺肌症、宫颈上皮内瘤变行手术切除子宫及双附件的患者)，年龄28～70 岁，中位年龄 50.7 岁。所有标本置入液氮迅速冷冻，-80℃保存。用于免疫组化的标本离断后在4%的多聚甲醛中固定24 h。

2 检测方法 ①实时荧光定量PCR检测：利用TRIzol试剂提取标本中的总RNA，之后迅速应用目的基因特异性上下游引物(P62，上游5'-GAGCAGCATCCAACCAAA-3'，下游5'-CGTCTCCTGGAGGCATA-3'；Nrf2，上游5'-CCAACACACGGTCCACAGCT-3'，下游5'-TCCGTCGCTGACTGAAGTCAA-3')，SYBR Premix Ex TaqTMII (Takara)和iQ5 Multi-color RT-PCR 反应系统对目的基因片段进行扩增。引物均由TaKaRa生物技术公司(Dalian，China)设计合成。用ABI prime 7000 SDS软件分别测出每个样品Nrf2、P62 mRNA的CT值，2-△△Ct方法计算该基因的相对表达量。②免疫组化法检测：用免疫组化检测P62和Nrf2的表达情况。一抗购自Abcam公司：Nrf2 (ab62352，1∶200，HK)、CXCR4(ab2074，1∶50，HK)。石蜡标本使用3% H2O2在室温下作用30 min以完全除去过氧化物酶的活性，用20%的山羊血清结合非特异性蛋白。在4°C条件下孵育一抗过夜。第2天用TBS洗标本3次并在室温条件下用孵育生物素标记的二抗作用30 min。对10个随机视野阳性细胞的百分比计数，分数分级如下：1分，<25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，>76%。染色强度所得分数如下分级：0分，无染色；1分，弱表达染色；2分，中度表达染色；3分，强表达染色。将上述两种评分值相加，并根据总分值将标本分为4组：6～7分，强表达组()；4～5分，中等表达组()；1～3 分，弱表达组(+)；阴性组 (-)，0分。出现阴性和弱表达情况则判定为该基因阴性表达，而中等和强表达则判定该基因阳性表达。

3 统计学方法 数据统计应用SPSS 20.0统计学软件，相关性应用参数统计中 Spearman 等级相关进行分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 Nrf2 mRNA和蛋白表达情况 Nrf2 mRNA在肿瘤组织中的相对表达量较正常组织明显增高[(3.2543±0.7727)与(1.6463±0.2966)P< 0.01)。肿瘤组织中Nrf2阳性表达率为61.4%(43/70)，明显高于正常组织中的(25/70，35.7%) (P<0.05)。结合临床病例特征，Nrf2 阳性表达和肿瘤的MDACC分型(P=0.003)、IFGO分期(P=0.036)、大网膜转移(P=0.036)密切相关。

2 P62 mRNA和蛋白表达情况 P62 mRN在肿瘤组织中的表达量明显高于正常组织[ (3.0345±0.7767) 与(1.3232±0.5988)P<0.01]。P62蛋白在肿瘤组织中的阳性表达率为54.3%(38/70)，高于正常组织的(28/70，40.0%) (P<0.01)。结合临床病例特征，P62蛋白的阳性表达和与MDACC分型(P=0.008)、组织学分级(P=0.021)、IFGO分期 (P=0.018)相关。

3 Nrf2和P62表达在卵巢癌组织中的相关性 见表1。将标本分为4组: Nrf2+/P62+，Nrf2-/P62+，Nrf2+/P62-和Nrf2-/P62-。发现Nrf2和P62的表达存在显著相关性(r=0.274，P<0.05)。提示在卵巢癌组织中P62表达上调可能受到Nrf2蛋白表达水平的影响。正常组织中未观察到明显的相关性。

表1 Nrf2与P62蛋白表达在卵巢癌组织中的相关性

4 Nrf2 和P62表达与卵巢癌患者生存时间的关系 见图1。

A：Nrf2的表达与预后；B：P62的表达与预后；

70例随访持续到2016年12月，42例在随访期间死亡，生存时间9～60个月，中位生存时间52.9个月。卵巢癌患者不同分组(Nrf2+/P62+，Nrf2-/P62+，Nrf2+/P62-和Nrf2-/P62-)的生存情况，其中Nrf2+/P62+组的中位生存时间为28.0个月，相较于其他分组病人的预后更差(P<0.01)。

讨 论

本研究探讨了卵巢癌患者临床标本中Nrf2和P62的表达对临床病理数据和生存情况的影响。结果表明Nrf2和P62基因的mRNA和蛋白在肿瘤组织中的表达要明显高于正常组织，Nrf2的高表达和肿瘤的MDACC分型(P=0.003)、IFGO分期(P=0.036)、大网膜转移(P=0.036)密切相关，与此同P62高表达和MDACC分型(P=0.008)、组织学分级(P=0.021)、IFGO分期 (P=0.018)相关。同时表明在卵巢癌患者临床标本中Nrf2和P62的表达之间有很强的相关性。同时生存分析表明二者双阳性表达组往往意味着更差的预后。

在肿瘤生长的过程中，肿瘤细胞的生长增值过程中会产生大量的ROS，最终激活Nrf2通路[6]。作为一种核转录因子，Nrf2可以特异性的识别抗氧化反应元件ARE，从而激活下游ARE依赖的相关酶类[5]。近来相关证据表明，Nrf2有助于肿瘤细胞维持干性及抵抗放化疗[7]。Nrf2无论是在正常细胞还是恶性细胞中都扮演了保护者的角色。

卵巢癌标本中的Nrf2表达相对较高，同时Nrf2的高表达与肿瘤大小密切相关。肿瘤越大往往意味着缺氧越严重，细胞压力越高，在这种情况下Nrf2通路将被广泛激活。同时我们发现Nrf2与肿瘤分期关系密切，这提示Nrf2通路在卵巢癌的进展中十分重要，与患者的预后评价密不可分[7-8]。

综上所述，Nrf2和P62的过表达在卵巢癌进展中扮演了重要的角色，两者之间可能存在着某种密切的联系，且与患者不良预后相关。因此针对两者的研究可能帮助我们发现新的治疗卵巢癌的靶点。

[1] Sporn MB.NRF2 and cancer：the good，the bad and the importance of context[J].Nat Rev Cancer，2012，12(8)：564-571.

[2] Sirota R，Gibson D，Kohen R.The role of the catecholic and the electrophilic moieties of caffeic acid in Nrf2/Keap1 pathway activation in ovarian carcinoma cell lines[J]. Redox Biol，2015，4：48-59.

[3] Manandhar S，Choi BH，Jung KA，etal. NRF2 inhibition represses ErbB2 signaling in ovarian carcinoma cells: implications for tumor growth retardation and docetaxel sensitivity[J].Free Radic Biol Med，2012，52(9)：1773-1785.

[4] Efeyan A，Comb WC，Sabatini DM.Nutrient-sensing mechanisms and pathways[J].Nature，2015，517(7534)：302-310.

[5] Jiang X，Overholtzer M，Thompson CB.Autophagy in cellular metabolism and cancer[J].J Clin Invest，2015，125(1)：47-54.

[6] 李兴媚.抑制ERK1/2通路对卡铂诱导人卵巢癌细胞凋亡的影响[J].陕西医学杂志，2016，45(5)：522-523.

[7] Martinet W，De Meyer GR. Autophagy in atherosclerosis: a cell survival and death phenomenon with therapeutic potential[J]. Circ Res，2009，104(3)：304-317.

[8] Kim YC，Guan KL.Mtor：a pharmacologic target for autophagy regulation[J]. J Clin Invest，2015，125(1)：25.

*西安市科研教育项目(2013013)

卵巢肿瘤 基因表达调控，肿瘤 预后 NF-E2相关因子2 @P62

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.011

(收稿：2017-02-17)