高通量测序平台对卵巢癌基因突变的检测及意义*

姜向阳，李兴珍，刘文康，吴志新，李帅帅，张恩科，赵清侠

陕西省人民医院(西安710068)

△通讯作者

高通量测序平台对卵巢癌基因突变的检测及意义*

姜向阳，李兴珍，刘文康，吴志新，李帅帅，张恩科，赵清侠△

陕西省人民医院(西安710068)

目的：利用高通量测序平台研究卵巢癌基因突变的分布和特点，寻找相应的突变靶点，并对突变位点的类型和频度进行分析。方法：取自临床上卵巢癌的组织石蜡标本16例，运用高通量基因测序Ion torrent PGM平台，对50个基因2835个位点进行检测。结果：50个基因中突变集中在EGFR、KDR 、KIT、KRAS、NOTCH1、SMAD4、TP53等7个基因21个位点上。其中TP53突变比例高达75%，且突变点是4号外显子c.215C>G的比例最高。结论：卵巢癌患者可以根据基因突变靶点进行精准治疗，TP53的高突变比例提示其在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，结合临床可为复发转移预测提供依据。

近30年来卵巢癌病因学的认知，复杂的异质性、肿瘤微环境的特异性等生物学特性研究不断深化[1]，手术及化疗方案都有了很多的改进[2]，但是患者的生存率没有太大的变化。靶向治疗能影响肿瘤细胞、基质、血管或细胞信号传导通路。研究发现，血管内皮细胞生长因子(VEGF)在卵巢癌中过度表达，并与顺铂耐药性的增加有关，贝伐单抗能靶向作用于 VEGF-A 的活性形式，从而抑制血管生成和肿瘤的生长，抑制转移扩散，患者的无进展生存期增加[3]。从基因的表达到DNA测序，从焦磷酸测序，Sanger测序到高通量测序(High-throughput sequencing)又名下一代测序(Next generation sequencing，NGS)，技术平台有了突飞猛进的发展。本研究运用NGS平台，检测卵巢癌患者的基因突变图谱，尤其是TP53的突变分析，结合病理及临床分型，药物疗效等方面，探讨TP53的突变情况及与卵巢癌，尤其是上皮性卵巢癌的相关性。

对象和方法

1 研究对象 肿瘤标本全部来源于我院2014年5月至2016年6月收治的16例上皮性卵巢癌患者，年龄38～81岁，平均(60.31±5.53)岁。病理分型：低分化腺癌13 例，高分化腺癌2 例，颗粒细胞瘤1例；上皮性卵巢癌14例，颗粒细胞瘤1例，胃转移卵巢癌1例。临床分期：ⅡC 2 例，ⅢC 13例，Ⅳ期1例。淋巴转移3例，复发7例，腹腔转移1例，肝转移1例，肺转移1例，未复发2例，因肺部感染死亡1例。

2 研究方法 ①DNA准备：为保证FFPE切片组织中含有足够比例的肿瘤细胞，需请病理科事先对该切面的肿瘤组织进行HE染色，确保所切层面中肿瘤组织占70%以上、且坏死组织比例少于10%。采用切片厚度5～10 μm，数量6～8张。②DNA提取：采用QIA amp DNA Mini Kit (Qiagen)试剂盒对组织进行DNA提取。③质控：DNA定量(Qubit2.0)Agilent2100质控，提取片段长度在170 bp左右，组织样本DNA的Qubit定量浓度>50 ng/μl。④Ion文库构建：采用AmpliSeqTMLibrary Kit2.0(Life Technologies 生产 )标准试验方案建库。⑤测序：高通量测序样品上机深度测序(测序仪：Ion Torrent PGMTM)；测序结果质控(长度分布，QC均一性，测序碱基质量，Amplicons覆盖度等)。比对率>95%、reads长度主要分布在100 bp左右、GC含量均一、Q>20、覆盖度：组织>1000×。

3 统计学方法 使用北京圣谷同创科技发展有限公司自主研发的SV-DNA filter进行背景突变过滤，保证突变检出的敏感度、准确性及肿瘤相关性；对最终的突变点进行计算统计比较分析。

结 果

1 基因突变谱检测 高通量测序平台检测国内外研究热点的50个基因，覆盖2835个位点，共检测了16例卵巢癌患者的基因突变谱。检测的50个基因中，发生突变的基因有7个，见表1。

表1 发生突变的基因分布比例

2 TP53突变分布 见表2。TP53突变频率较高，在检测的16例卵巢癌患者中有12例发生了TP53基因突变，其中3例在2个外显子上发生了突变，突变数量为15个。突变的外显子涉及5个，分别是Exon4、5、6、7、8，突变类型为错义突变和删除(缺失)突变。

表2 TP53突变分布[突变(%)]

3 TP53突变位点分布 TP53的错义突变位点多集中在4号外显子第215号核苷酸，C突变为G，与之对应的72号氨基酸由脯氨酸突变为天冬氨酸(c.215C>G，p.72P[Pro]=>R[Arg])。

讨 论

本次研究检测50个肿瘤相关基因的2835个位点，卵巢癌的突变集中在EGFR、KDR 、KIT、KRAS、NOTCH1、SMAD4、TP53等7个基因，针对靶点的药物治疗，成为精准个体化治疗的一部分，并取得了可靠的患者反馈。1例EGFR基因21号外显子c.2573T>Gp.858L突变给予酪氨酸激酶抑制剂，KDR基因7号外显子c.889G>Ap.297 突变应用抗VEGF类药物疗效显著，毒副作用较少，患者主观感受较好。

P53蛋白约为53千道尔顿(53kD)，是由TP53基因编码的，定位于人17号染色体短臂的pl3.1上，它对于抑制癌症的发生发挥着十分关键的作用。在超过半数的人类肿瘤中，P53都表现为突变或者基因的缺失[4]。突变的P53不仅丧失了并抑制野生型P53抑制肿瘤的功能，它同时表现为获得性的新功能。这种获得性功能在肿瘤发生发展的各个阶段发挥着重要的促进作用[5]。TP53基因的突变形式各异，位点分布也不相同。本研究中TP53基因突变率高达75%，16例患者有1例是初诊，于2016年5月行卵巢减灭术；15例患者均在2011-2015年做过卵巢肿瘤减灭术，术后复发7例，6例发生转移；2例未复发转移的患者为2015年初诊发现肿瘤，且TP53基因均有突变。复发转移率81.25%，13例转移复发的患者中11例发生了TP53基因的突变，突变率为84.62%。卵巢颗粒细胞瘤是卵巢性索间质肿瘤中常见的肿瘤，属于低度恶性，复发几率较低，本研究中有1例，TP53基因4号外显子上发生了c.215C>Gp.72和 c.314delGp.105fs错义和缺失突变，该患者减瘤术后复发，以上结果显示TP53基因与卵巢肿瘤的发生发展密切相关。

有文献报道，在消化系统肿瘤中的TP53突变频率较高，多在5、6、7、8外显子的不同位点上[6]。本研究显示TP53突变高发在4号外显子的215核苷酸序列上，是不是提示卵巢癌的突变有差异性，我们将进一步关注。

卵巢癌手术减瘤后，开展联合治疗，依据高通量基因检测突变信息，筛选靶向药物，制定个体化的用药方案[7]，做到“精准治疗”，提高患者的治疗依从性，减少化疗药物毒副作用，提高5年生存率。同时结合肿瘤标志物，还未发生转移或复发的患者，进行预测、早期发现、早期干预；结合NGS平台提供的基因测序大数据分析，综合临床资料的研究，更好的为患者服务。

[1] Nurul-Syakima AB，Mutalib B.Molecular characterization of serous ovarian carcinoma using a multigene next generation sequencing cancer panel approach[J].BMC Research Notes，2014，7：805.

[2] 华 瑛，姚安梅，杨 浩.紫杉醇联合顺铂或奈达铂治疗晚期卵巢癌临床对比观察[J].陕西医学杂志，2013，42(11)：1533-1534.

[3] Hamerlik P，Lathia JD，Rasmussen R，etal.Autocrine VEGF-VEGFR2-Neuropilin-1 signaling promotes gliomastem-like cell viability and tumor growth [J] . J Exp Med，2012，209(3)：507-520.

[4] Stijn C.Target-Enriched Next-Generation Sequencing Reveals Differences between Primary and Secondary Ovarian Tumors in Formalin-Fixed，Paraffin-Embedded Tissue[J].JMD，2015，17(2)：193-200.

[5] Sunghee W.Proteogenomic strategies for identification of aberrant cancer peptides using large-scale next-generation sequencing data[J].Proteomics，2014，14(23)：2719-2730.

[6] Xu Z，Huo XY，Ye H，etal.Genetic Mutation Analysis of Human Gastric Adenocarcinomas Using Ion Torrent Sequencing Platform [J]. PLOS ONE，2014 9(7)：e100442.

[7] 蔡祖艾，王 琪，张 玮，等.以基因通路富集法探索上皮性卵巢癌多药耐药相关生物学通路及功能性SNP位点[J].中国癌症防治杂志，2014(2)：127-132.

Geneticmutationanalysisofhumanovariancancerusingnext-generationsequencingplatform

Jiang Xiangyang，Li Xingzhen，Liu Wenkang，et al.

Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Objective：Using NGS sequencing platform，study the distribution and characteristics of ovarian cancer gene mutations and look for targets of medicines; by analysis the mutation sites，types and frequency ，combined with the tumor markers，predict the recurrence or metastasis，then screening，early intervention on a regular basis.Methods：16 cases from ovarian tissue paraffin specimens by clinically confirmed，using the high-throughput sequencing Ion torrent PGM platform，test the 2835 gene loci of 50 genes and the data analysis. Results：50 genes mutations were in the concentrated in EGFR，KDR，KIT，KRAS，NOTCH1 and SMAD4，TP53 seven 21 gene loci. TP53 mutations among the proportion were as high as 75%，and mutation of 4 exon c.215C>G has the highest percentage. Conclusion：The patients with ovarian cancer can be according to the target gene mutations in accurate treatment，TP53 high mutation rate suggests it plays an important role in the occurrence of tumor development，combined with clinical study can provide the basis for recurrent branch predictions.

Ovarian neoplasms Gene conversion High-throughput nucleotide sequencing Genes，p53

*西安市科技计划项目[SF1510(3)]

卵巢肿瘤 基因转变 高通量核苷酸测序 基因，p53

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.009

(收稿：2017-02-13)