去铁胺在小鼠局灶性脑缺血损伤中的保护作用*

苏永永，吴鹏昌，谢江涛，向 毅，王世锋，武兴兴，刘振锋△，姜海涛

1.陕西省咸阳市中心医院神经外科(咸阳712000)，2.西安交通大学第一附属医院神经外科(西安710061)

△通讯作者

去铁胺在小鼠局灶性脑缺血损伤中的保护作用*

苏永永1，吴鹏昌1，谢江涛1，向 毅1，王世锋1，武兴兴1，刘振锋1△，姜海涛2

1.陕西省咸阳市中心医院神经外科(咸阳712000)，2.西安交通大学第一附属医院神经外科(西安710061)

目的：探讨去铁胺在小鼠局灶性脑缺血损伤中的保护作用。方法：健康雄性C57BL/6J小鼠30只，随机分为假手术组、模型组、去铁胺处理组，每组小鼠10只；假手术组只做颈总动脉及颈内、颈外动脉分离，不进行线栓插入。模型组及去铁胺处理组行小鼠局灶性脑缺血损伤，实验开始前1 h，去铁胺组小鼠腹腔注射0.9%生理盐水溶解的去铁胺(50 mg/kg)，假手术组及模型组同样时间点腹腔注射等体积生理盐水。小鼠局灶性脑缺血损伤24 h后进行mNSS行为学评分，之后处死小鼠，干湿重法检测脑组织含水量、TTC染色检测小鼠脑梗死体积百分比，脑组织切片行Neun免疫荧光染色。结果：去铁胺处理组小鼠mNSS评分(9.25±1.52)较模型组小鼠评分(13.50±1.50)明显低(P<0.05)，去铁胺处理组小鼠脑含水量(80.15±0.72)%较模型组小鼠脑含水量(84.25±0.56)%低(P<0.05)，去铁胺预处理后可明显减轻小鼠局灶性脑缺血梗死体积(P<0.05)。观察神经元Neun免疫荧光染色可见，模型组神经元细胞明显减少(90.0±11.0)，而去铁胺处理组则神经元减少较模型组(180.0±15.0)多(P<0.05)。结论：在小鼠局灶性脑缺血损伤中，去铁胺预处理后可减轻小鼠神经行为损伤评分、减轻脑水肿及脑梗死体积，抑制脑组织神经元细胞死亡，提示去铁胺在局灶性缺血性脑损伤中具有一定的保护作用。

随着人们生活水平提高及老龄化的到来，缺血性脑损伤的发病率逐年提高，已经成为临床上的常见病、多发病之一，该疾病有着高致死率及致残率，给社会和家庭带来沉重负担，有关缺血性脑损伤的发病机制及脑保护性药物的研究一直是医学研究热点[1-2]。铁离子参与脑内发育、代谢和功能等重要活动，然而研究发现脑内铁离子的过量累积(铁过载)可能具有一定的神经毒性并参与了诸多神经系统疾病的发生、发展。一种铁离子的螯合剂—去铁胺 (Deferoxam ine，DFO)，被证实能够拮抗这种铁离子超载所引起的神经损伤，该保护作用在创伤性颅脑损伤、出血性脑卒中、阿尔兹海默症、帕金森病等疾病的研究中初步得到证实[3-4]。本实验旨在探索在小鼠局灶性脑缺血损伤中早期给予去铁胺后是否同样具有神经保护作用。

材料与方法

1 仪器与试剂 德国LEICA手术显微镜；全自动脱水机(BLEICA ASP300型，德国);德国LEICA公司石蜡包埋机；德国LECIA公司石蜡切片机；日本Olympus 公司BX41荧光显微镜；美国Media Cybernetics公司Image Pro Plus 6.0 ( IPP 6.0)彩色医学图像分析软件；一抗：山羊抗小鼠NeuN抗体(Gene Tex公司)。

2 实验动物及分组 健康雄性C57BL/6J小鼠30只，购自西安交通大学动物实验中心，体重20～25 g，随机分为三组：假手术组、模型组、DFO处理组，每组10只小鼠。DFO购自瑞士诺华制药有限公司，DFO溶于0.9%生理盐水中，实验开始前1 h，DFO处理组小鼠腹腔注射DFO(50 mg/kg)，假手术组及模型组小鼠于同样时间点腹腔注射等量生理盐水。实验过程符合动物实验伦理学要求。

3 小鼠局灶性脑缺血模型的制备 应用改良Longa线栓法制作小鼠局灶性脑缺血损伤模型(MCAO)[5]。以1%戊巴比妥钠，45 mg/kg，腹腔注射法对实验小鼠实施麻醉，麻醉成功后将小鼠仰卧位固定于手术操作台，剪去小鼠颈部毛发，常规碘伏消毒，经颈部正中切口暴露下颌腺体，牵开腺体，逐层分离，暴露小鼠右侧颈总、颈内及颈外动脉。穿细线结扎颈外动脉及颈总动脉，在颈内动脉远心端处穿细线打一活结备用，斜45°在颈总动脉上剪一小口，线栓通过剪开的小口进入颈总动脉，穿入颈内动脉直达中动脉起始端(以颈内、颈外动脉分叉处计算，进线深度约1.1 cm，插入线栓遇轻微阻力感即停止进线)，结扎颈内动脉处预先备好的细线，固定线栓，间断缝合后手术完成，将术后的小鼠放入37 ℃恒温箱单笼饲养，自由进饮食，术后2 h后根据Longa评分法[6]，评分达到1～3分者，表示模型成功，假手术组小鼠手术同上，但不插入线栓。

4 行为学评分 应用改良版神经损伤严重性(mNSS)评分法对小鼠进行行为学评分[7]，mNSS评分从运动、感觉、平衡和反射四个方面进行神经损伤评分，共计18分，0分正常，分值越高损伤越严重，所有小鼠在手术后24 h进行评分并记录。

5 脑组织含水量计算 采用干湿重法计算脑组织含水量，脑缺血损伤后24 h，断头法处死小鼠，快速取出脑组织，在电子天平秤上称重，然后将小鼠脑组织放入温度为80 ℃的恒温烤箱中烘烤，待脑组织重量恒定后秤取重量，脑含水量计算：(湿重-干重)/湿重×100%。

6 脑组织梗死体积百分比计算 小鼠缺血性脑损伤24 h后，断头法取脑，将脑组织置于小鼠脑磨具中，以2 mm为厚度行脑组织切片，切片侵泡于PBS配置好的浓度为2% ，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染液，染色约30 min后取出。观察梗死情况，用Image Pro Plus6.0软件计算梗死体积百分比。

7 神经元Neun免疫荧光染色 于脑缺血损伤24 h取梗死灶周围脑组织进行石蜡切片，脱蜡，梯度酒精脱水，柠檬酸高压高热法抗原修复，0.01 mol/L PBS漂洗3×5 min，加封闭血清，再用0.01 mol/L PBS 漂洗1次，加一抗(Neun1∶100稀释)，孵育 1 h，室温过夜。0.01 mol/L PBS 漂洗3次，加荧光二抗，37 ℃，孵育1 h。0.01 mol/L PBS 漂洗3×5 min，甘油封片。显微荧光镜观察，由未参与实验者在20×放大倍数下随机拍照选取Neun阳性染色细胞，计算每个视野阳性细胞数量，重复6次取均值。

结 果

1 神经损伤行为学评分及脑组织含水量检测结果 见表1。所有实验小鼠均进行mNSS神经损伤评分，假手术组神经损伤评分为0分，DFO组缺血24 h后神经损伤评分(9.25±1.52)，较模型组缺血损伤 24 h评分(13.50±1.50)低 (P<0.05)。小鼠脑缺血损伤24 h后脑组织含水量检测结果显示，DFO处理组小鼠脑组织含水量明显较模型组低 (P<0.05)。

表1 各组小鼠mNSS行为学评分、脑含水量检测比较

2 脑梗死体积百分比 见图1、2。小鼠脑缺血损伤24 h后脑组织TTC染色，其中白色为缺血梗死脑组织，红色为正常脑组织。图中可见假手术组无梗死脑组织，DFO组及模型组均可见梗死脑组织，其中DFO组小鼠脑梗死体积百分比较模型组低 (P<0.05)。

白色：梗死脑组织，红色：正常脑组织

DFO组与模型组比较，*P<0.05

3 神经元Neun染色 见图3。脑缺血损伤24 h后取脑缺血损伤病灶周围脑组织切片进行神经元免疫荧光染色，可见假手术组Neun阳性染色分布均匀，阳性细胞数高(230.0±20.0)；模型组阳性细胞数明显减少(90.0±11.0)，而DFO处理组Neun阳性数明显较模型组多(180.0±15.0)，DFO组较模型组存活神经细胞明显增加(P<0.05)。

讨 论

大量研究结果认为，铁过载后可以通过Fenton反应增加自由基形成，介导炎症反应造成神经细胞氧化应激损伤，最终导致神经细胞死亡[8]。DFO是一种铁离子螯合剂，临床上主要用于治疗慢性铁负荷过量等疾病，DFO可以通过和游离铁离子发生螯合反应以减轻铁离子在组织中的过载，基于DFO的这一作用，人们推测DFO可以通过对抗铁过载从而抑制铁过载引起的脂质过氧化、氧化应激损伤等一系列病理生理过程，进而发挥一定的临床治疗效果。张均礼等[3]在大鼠创伤性脑损伤研究中证实了去铁胺的治疗效果，发现早期给予 DFO 治疗，能显著减轻大鼠脑缺损体积和致伤灶周围神经元损伤并改善大鼠空间学习记忆能力，同样在脑出血、蛛网膜下腔出血等疾病中DFO的脑保护作用同样得到了证实。创伤性颅脑损伤、脑出血、蛛网膜下腔出血等疾病有着共同的病理生理机制，我们猜测是否在缺血性脑损伤中DFO同样发挥着脑保护作用？首先本实验通过行为学比较发现，在缺血性脑损伤中，DFO处理组小鼠神经行为学损伤明显较假手术组损伤轻。其次，我们应用干湿重法及脑梗死体积百分比比较发现，DFO处理组小鼠脑含水量、梗死体积百分比等明显较假手术组低。实验证实，在缺血性脑损伤中DFO同样可以减轻损伤后小鼠脑组织的梗死体积，减轻脑水肿。Neun染色作为一种神经元细胞核的特异性标记物染色，可以观察脑组织神经元损伤情况，实验中发现，小鼠脑缺损伤后脑组织切片Neun荧光染色阳性细胞数均较假手术组少，然而去铁胺处理组小鼠脑组织切片Neun荧光染色阳性细胞数较模型组多，说明去铁胺处理后对神经元具有保护作用。

实验表明，应用DFO治疗后可以明显减轻缺血性脑损伤小鼠的神经行为学损伤、减轻脑组织水肿及梗死体积，抑制神经元细胞坏死等，从而在缺血性脑损伤中发挥积极作用。

[1] 杨鲜珍，王淑英，赵立法.脑栓康对小鼠急性脑缺血保护作用的实验研究[J].陕西中医，2011，32(4)：487-488.

[2] 王凯华，任 丁，黄龙坚.补阳还五汤对大鼠脑缺血再灌注后JAK2/STAT3的影响[J].陕西中医，2013，34(8)：1093-1096.

[3] 张均礼，胡 荣，李 飞，等.去铁胺对大鼠大脑冲击伤的治疗作用[J].第三军医大学学报，2012，34(23)：2349-2352.

[4] 艾玲玲，谭晓东，杨露露，等.去铁胺对帕金森SHSY5Y细胞的保护作用[J].中国现代医生，2013，51(3)：7-9.

[5] Steiner B，Roch M，Holtkamp N，etal.Systemically administered human bone marrow-derived mesenchymal stem home into peripheral organs but do not induce neuroprotective effects in the MCAo-mouse model for cerebral ischemia[J]. Neurosci Lett，2012，513(1)：25-30.

[6] Yang W，Shen Y，Chen Y，etal. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor prevents neuron loss via inhibiting ischemia-induced apoptosis[J]. J Neurol Sci，2014，344(1-2)：129-138.

[7] Mao L，Jia J，Zhou X，etal. Delayed administration of a PTEN inhibitor BPV improves functional recovery after experimental stroke[J]. Neuroscience，2013，23(1)：272-281.

[8] 梁 瑞，吴 鹤，戚基萍，等.活化的小胶质细胞在脑出血后的作用[J].现代医学，2015，43(2)：262-265.

*陕西省卫生和计划生育委员会科研项目(2014E16)

缺氧缺血，脑/药物疗法 去铁胺/治疗应用 铁过载

R651.19

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.007

(收稿：2017-01-12)