miR-425调控PDL-1通路调节肾上皮细胞增殖、凋亡作用的实验研究*

蒋小丽，周慧芳，毛能建

新疆维吾尔自治区喀什地区第一人民医院检验科(喀什844000)

miR-425调控PDL-1通路调节肾上皮细胞增殖、凋亡作用的实验研究*

蒋小丽，周慧芳，毛能建

新疆维吾尔自治区喀什地区第一人民医院检验科(喀什844000)

目的：探讨miR-425通过调控PDL-1通路调节肾上皮细胞的增殖及凋亡作用。方法：肾上皮细胞HRCEpiC分别转染miR-425模拟物及对照模拟物，采用qRT-PCR方法检测miR-425表达水平，采用MTT法与Tunel试验测定细胞增殖及凋亡作用，采用Western blot实验测定PDL-1表达水平。结果： qRT-PCR结果显示转染后实验组miR-425的表达水平较空白组、阴性对照组升高约37.82倍。转染48 h后实验组、阴性对照组与空白组的活细胞比例分别为(75.22±3.19)%、(98.29±2.11)%和(100±0.00)%，细胞凋亡率分别为(17.20±2.49)%、(4.29±1.44)%和(0.52±0.11)%，组间对比差异有统计学意义(P<0.05)；转染48 h后Western blot检测显示实验组的PDL-1表达水平都明显低于阴性对照组与空白组(P<0.05)。结论：miR-425可通过激活PDL-1通路，降低肾上皮细胞增殖能力，提高其凋亡能力，从而介导肾上皮细胞的生物学行为。

材料与方法

1 材 料 肾上皮细胞HRCEpiC源于中国医学科学院细胞中心，选择RPMI1640+10%血清进行培养(5%CO2、37℃孵箱)；miR-425模拟物及对照模拟物购自Ambion 公司；免疫印迹化学发光(ECL)系统购自美国Syngene公司；兔抗人β-actin单克隆抗体购自Abcam公司，兔抗人PDL-1单克隆抗体及相应二抗及荧光二抗均购自Santa Cruz公司；脂质体Lipo-fectamine2000购自Invitrogen公司；MTT检测试剂盒购自美国Sigma 公司。

2 实验方法 ①细胞增殖实验：选择HRCEpiC细胞中通过脂质体转染试剂瞬时转染miR-425模拟物及对照模拟物，并通过Real time PCR分别验证转染效率。将转染后的细胞株分别以5000个/孔的密度接种于96空培养板中，培养48 h后，应用MTT试剂盒测定细胞增殖性，各实验均重复接种于3个孔中。②细胞凋亡实验：采用原位细胞凋亡检测技术(Tunel试验)，HRCEpiC细胞在96孔培养48 h后取1 ml细胞，1000 r/min，4 ℃离心10 min，取沉淀，PBS重悬细胞，离心后取呈现，加入300 μl凋亡检测缓冲液，以每个象限的细胞数目是检测细胞总数所在点的百分比计算凋亡率，各实验均重复接种于3个孔中。③Western blot实验：在miR-425瞬时转染分别在48 h 后提取细胞总蛋白，并用BCA法测定蛋白浓度。各组取等量浓度的蛋白样本，进行SDS-PAGE 凝胶电泳，然后将蛋白转移至PVDF 膜上，封闭后加入一抗PDL-1，4 ℃过夜。TBST洗膜30 min，加入二抗室温孵育1 h，TBST 洗膜30 min，加入ECL发光剂，进行电脑扫描发光。

结 果

1 转染效果 肾上皮细胞HRCEpiC分别转染miR-425模拟物为实验组，转染对照模拟物为阴性对照组，转染组为空白组。qRT-PCR结果显示转染后实验组miR-425的表达水平较空白组、阴性对照组升高约37.82倍，见表1。

表1 miR-425转染后的ct值对比

2 细胞增殖情况对比 转染48 h后实验组、阴性对照组与空白组的活细胞比例分别为(75.22±3.19)%、(98.29±2.11)%和(100±0.00)%，组间对比差异有统计学意义(P<0.05)。

3 细胞凋亡情况对比 转染48 h后实验组、阴性对照组与空白组的细胞凋亡率分别为(17.20±2.49)%、(4.29±1.44)%和(0.52±0.11)%，组间对比差异有统计学意义(P<0.05)。

4 PDL-1表达对比 转染48 h后Western blot检测显示，实验组的PDL-1表达水平(0.51±0.01)明显低于阴性对照组(0.65±0.04)与空白组(0.69±0.06)(P<0.05)。

讨 论

肾上皮细胞的作用是多方面的，首先上皮细胞通过不断的增殖，对损伤的肾组织进行修复，维持上皮细胞屏障结构的完整性[4]。另外上皮细胞的效应进一步扩展为潜在的直接免疫调节作用，且这种作用与炎症刺激时间之间具有一定的相关性[5]。比如HRCEpiC能产生IL-8或直接趋化白细胞参与急性炎症反应，可参与肾免疫损伤的发生[6]。

MicroRNA是一类21-23 nt的非编码小分子RNA，它们通过与靶mRNA的编码区、3'-UTR完全或部分配对，降解靶mRNA或抑制其蛋白质翻译，在转录后水平负调控靶基因的表达[7]。miR-425家族在上皮细胞的形成过程中发挥重要作用，抑制上皮细胞形成过程，促进E-钙黏蛋白表达[8]。本研究显示转染后实验组、阴性对照组与空白组的活细胞比例分别为(75.22±3.19)%、(98.29±2.11)%和(100±0.00)%，组间对比差异有统计学意义(P<0.05)；转染48 h后实验组、阴性对照组与空白组的细胞凋亡率分别为(17.20±2.49)%、(4.29±1.44)%和(0.52±0.11)%，组间对比差异有统计学意义(P<0.05)，表明miR-425表达与肾组织细胞增殖能力呈负相关，与凋亡能力成正相关，miR-425可能参与肾上皮细胞的调控。

PD1最有两个配体，分别是PDL-1(B7-H1)和PDL-2(B7-DC)，PDL-1蛋白广泛表达于抗原提呈细(APCs)、活化T、B细胞等。PDL-1与受体结合后可诱导内皮细胞生长、增殖，促进内皮细胞迁移[9]。本研究转染48 h后Western blot检测显示，实验组的PDL-1表达水平都明显低于阴性对照组与空白组(P<0.05)，表明miR-425可能参与PDL-1信号转导通路，从而参与调控肾组织的增殖与凋亡。

总之，miR-425可通过激活PDL-1通路，降低肾上皮细胞增殖能力，提高其凋亡能力，从而介导肾上皮细胞的生物学行为。

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miR-425regulatestheproliferationandapoptosisofrenalepithelialcellbyregulatingPDL-1pathway

Jiang Xiaoli，Zhou Huifang，Mao Nengjian.

Department of Laboratory，The First People’s Hospital of Kashgar Region，Kesha Xinjiang(Kashgar 844000)

Objective: To investigate the effects of miR-425 regulates the proliferation and apoptosis of renal epithelial cell by regulating PDL-1 pathway.Methods: Nasal polyp epithelial cells HRCEpiC were transfected miR-425 mimic and control，qRT-PCR method was used to detect the expression level of miR-425，MTT method and Tunel test were used to detect the cell proliferation and apoptosis，the level of PDL-1 expression were determined by Western blot experiment. Results：The results of qRT-PCR showed that the expression level of miR-425 in the experimental group was about 37.82 times higher than that in the blank group and the negative control group. After transfection of 48h，the proportion of live cells in the experimental group，negative control group and blank group were (75.22±3.19)%，(98.29±2.11)% and (100±0.00)%，the apoptosis rate were(17.20±2.49)%，(4.29±1.44)% and (0.52±0.11)%，there were statistically significant difference compared among the groups (P<0.05); Western blot assay showed that transfection after 48 h，the expression level of PDL-1 in the experimental group were significantly lower than the negative control group and blank control group (P<0.05).Conclusion: miR-425 can inhibit the proliferation of nasal polyps epithelial cells by increasing PDL-1 pathway，and improve the ability of apoptosis.

Renal epithelial cells Cell proliferation Apoptosis @miR-425 @PDL-1

*新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2016D01C022)

肾上皮细胞 细胞增殖 细胞凋亡 @miR-425 @PDL-1

R623.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.006

(收稿：2017-04-01)