芹菜素诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的实验研究*

孙晓力，翟宏军△，张心武，马小斌，马双余

1.西安交通大学第二附属医院普外科(西安710004)，2.西安交通大学第二附属医院肿瘤科(西安710004)

△通讯作者

芹菜素诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的实验研究*

孙晓力1，翟宏军1△，张心武1，马小斌2，马双余1

1.西安交通大学第二附属医院普外科(西安710004)，2.西安交通大学第二附属医院肿瘤科(西安710004)

目的：探讨芹菜素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡作用及相关机制。方法：常规培养人乳腺癌MDA-MB-231细胞，取对数期生长细胞分为芹菜素40、80、160 μmol/L组和空白对照组，分别用芹菜素40、80、160 μmol/L和生理盐水进行处理。处理24、48 h后，采用MTT法检测各组细胞的增殖情况，流式细胞仪检测处理48 h后凋亡和细胞周期情况，Western blot方法检测处理48 h后，Pro-Caspase-3、Caspase-3和Caspase-6蛋白的表达情况。结果：MTT和流式结果显示，芹菜素80、160 μmol/L 处理组在24、48 h均可显著抑制MDA-MB-231细胞的生长，且160 μmol/L 处理组比80 μmol/L处理组的抑制作用更强。40 μmol/L处理组在24 h显示对MDA-MB-231细胞的生长有一定作用，但与对照组相比无统计学差异。Western blot结果显示，芹菜素40、80、160 μmol/L组和空白对照组处理细胞48 h后，Caspase-3和Caspase-6蛋白表达水平随着芹菜素浓度的增高而依次上调，同时Pro-Caspase-3蛋白表达逐次降低。结论：芹菜素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖有抑制作用，并能诱导细胞的凋亡，其作用机制可能与Caspase-3、6信号通路的激活有关。

芹菜素广泛存在于水果和蔬菜中，并且具有抗炎、抗肿瘤以及自由基清除等作用[1-3]。研究结果显示，芹菜素可通过促进细胞周期停滞和凋亡作用来抑制细胞的生长[3-4]。本研究利用人乳腺癌MDA-MB-231细胞探讨芹菜素的体外抗肿瘤作用及其作用机制。

材料与方法

1 材料与试剂 人乳腺癌MDA-MB-231细胞株(美国细胞库，ATCC)；胎牛血清(FBS；Gibco，美国)；RPMI-1640培养基(Hyclone，美国)；青霉素、链霉素(Solarbio，中国)；MTT(Sigma，美国)；BCA蛋白定量试剂盒(Pierce，美国)；Bio-Rad protein assay和预染蛋白质分子量标准(Bio-Rad，美国)；Annexin V-FITC/PI双染检测凋亡试剂盒(Beckman Coulter，美国)；碘化丙啶(PI；Sigma，美国)。

2 实验方法 ①实验分组：将人乳腺癌MDA-MB-231细胞培养于含1%青链霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，5% CO2、37 ℃培养箱中常规培养，细胞处于对数生长期时将细胞分为芹菜素40、80、160 μmol/L组和空白对照组，按照分组条件分别用芹菜素40、80、160 μmol/L和生理盐水处理。②MTT法检测细胞增殖：取对数生长期MDA-MB-231细胞，以5×104个/孔的密度接种于96孔板中，待细胞完全贴壁后，按照分组条件分别加入芹菜素40、80、160 μmol/L和生理盐水，其中每组设置5个复孔。于37 ℃培养箱培养24、48 h后，各组细胞分别加入5 mg/ml MTT 20 μl/孔，37℃培养箱培养4 h吸去上清液，每孔加150 μl 二甲基亚砜，摇床震荡溶解紫色结晶，酶标仪波长490 nm 处测定吸光度(A)值，检测各组细胞的增殖情况并绘图。③流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡：取对数生长期MDA-MB-231细胞，以2×105个/ml密度接种于6孔板中，孵育过夜后，按照分组条件处理细胞，48 h后每组收集1×105个细胞，PBS清洗后离心沉淀，70%乙醇溶液重悬并固定过夜，细胞经PBS清洗1次后离心收集，加入500 μl含50 μg/ ml PI、100 μg/ml RNase A、0.2% Triton X-100 的预冷PBS，避光放置30 min，流式细胞仪检测细胞周期；同样方法收集洗涤细胞，加入10 μl AnnexinV- FITC，冰上避光孵育15 min，离心去除上清，并用预冷缓冲液重悬，加入10 μl PI，混匀后样本置于冰上避光15 min，PBS清洗，1 ml PBS重悬后流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。④Western blot检测相关蛋白的表达：根据分组条件，收集处理完成的MDA-MB-231细胞，细胞裂解液冰上裂解。BCA试剂盒对蛋白浓度定量，按Bio-Rad说明书以总蛋白量20 μg/孔进行SDS-PAGE电泳。电泳后，凝胶上的蛋白转至PVDF膜。加入Pro-Caspase-3、β-actin、Caspase-3和Caspase-6小鼠单克隆抗体，二抗为山羊抗小鼠IgG-HRP，电化学发光显影，Alpha凝胶成像系统拍照。

3 统计学方法 采用 SPSS 19.0 统计学软件对数据行统计学分析，ANOVA重复测量方差分析法对各实验组和对照组间细胞生长水平差异比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 不同浓度芹菜素处理24、48 h对MDA-MB-231细胞增殖的影响 见图1。芹菜素80、160 μmol/L 处理组在24、48 h均可显著抑制MDA-MB-231细胞的生长，且160 μmol/L 处理组比80 μmol/L处理组的抑制作用更强。40 μmol/L处理组在24 h显示对MDA-MB-231细胞的生长有一定作用，但与对照组相比无统计学差异。芹菜素相同作用浓度下，处理时间越长则细胞生长抑制作用越强。

与空白对照组相比，**P<0.01，*** P< 0.001

2 不同浓度芹菜素处理对MDA-MB-231细胞凋亡的影响 见图2。不同浓度芹菜素处理细胞48 h后能够促细胞凋亡。和生理盐水处理组相比，80、160 μmol/L芹菜素处理48 h后可显著促进MDA-MB-231细胞凋亡，且凋亡率160 μmol/L处理组比80 μmol/L处理组更高。40 μmol/L处理组对MDA-MB-231细胞有一定的促凋亡作用，但与生理盐水组相比无统计学差异。芹菜素对细胞凋亡的作用依赖于药物浓度。

A：对照组；B:芹菜素40 μmol/L处理组；

3 不同浓度芹菜素处理对MDA-MB-231细胞周期的影响 见图3。对照组细胞大部分位于G0/G1期，80、160 μmol/L组在处理48 h后，细胞更多停留在G2/M期，40 μmol/L处理组虽然细胞进入G2/M期有一定促进作用，但与对照组相比无统计学差异。

4 不同浓度芹菜素处理对MDA-MB-231细胞Pro-Caspase-3、Caspase-3、Caspase-6蛋白表达的影响见图4。随着芹菜素浓度的增高，Caspase-3和Caspase-6蛋白表达水平依次上调，同时Pro-Caspase-3蛋白表达逐次降低。说明芹菜素可通过上调Caspase-3和 Caspase-6的表达水平，促进MDA-MB-231细胞的凋亡。

A：对照组；B:芹菜素40 μmol/L处理组；

图4 芹菜素处理MDA-MB-231细胞48 h后对Pro-Caspase-3、Caspase-3、Caspase-6蛋白表达的影响

讨 论

芹菜素(apigenin，C15H10O5)又被称为4，5，7-三羟基黄酮，是一种可从伞形科植物旱芹中分离提取的天然黄酮类化合物[5]，同时也广泛存在于水果、蔬菜、豆类以及植物源性的饮品中，因此被认为是黄酮的主要来源之一。本研究主要利用芹菜素对人乳腺细胞株MDA-MB-231进行干预，初步探讨芹菜素对乳腺癌细胞的增殖、凋亡以及细胞周期的影响。结果显示，芹菜素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞具有显著的抑制增殖和细胞周期的作用，并能明显促进MDA-MB-231细胞的凋亡，且作用依赖于时效和量效性。在此实验结果基础上，我们进一步检测了Caspase通路相关蛋白Pro-Caspase-3、Caspase-3和Caspase-6的表达情况，结果显示，芹菜素可显著上调Caspase-3和Caspase-6蛋白表达水平，同时下调Pro-Caspase-3蛋白表达水平，该作用具有一定量效性。这说明芹菜素可能通过Caspase途径上调Caspase-3和 Caspase-6的表达水平，诱导细胞凋亡，从而对人乳腺癌MDA-MB-231细胞产生抗肿瘤作用。

细胞凋亡是细胞发生程序性死亡的一系列有序的过程，在哺乳动物细胞中有两种核心途径可诱导凋亡的产生，外在的死亡受体途径以及内在的线粒体途径[6]。其中，内在途径与线粒体膜电位变化(ΔΨm)和线粒体通透性转变有关[7]。当细胞收到来自细胞内和细胞外的信号刺激时，线粒体外膜的渗透性发生改变，细胞色素C释放至胞质中，而释放的细胞色素C则可形成凋亡小体(一种由细胞色素C和凋亡蛋白酶激活因子1组成的蛋白复合物)激活Caspase通路，最终导致Caspase-9和随后的Caspase-3的活化，细胞发生不可逆的凋亡。Caspase蛋白家族是一类存在于细胞质当中的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，目前已发现14个成员，可分为三类：凋亡效应分子、凋亡启动分子以及促炎分子类。无论外在的死亡受体途径还是内在的线粒体途径，均需经过Caspase蛋白的活化和处理。其中，Caspase-3和Caspase -6属于凋亡效应分子，位于凋亡级联反应的下游，可直接使细胞发生凋亡。在本研究中，我们发现经芹菜素处理后的人乳腺癌MDA-MB-231细胞Caspase-3蛋白水平的显著上调，酶原形式的Pro-Caspase-3表达下降，因此可推断芹菜素能诱发Caspase-3的活化。在Caspase-3蛋白活化的同时，凋亡效应蛋白Caspase-6在芹菜素处理后也出现表达的上调。该结果提示芹菜素可直接或者间接诱发Caspase信号通路中效应蛋白Caspase-3和Caspase -6，对人乳腺癌MDA-MB-231细胞产生促凋亡的作用。

综上，芹菜素能抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖并诱导细胞的凋亡，其作用机制可能与芹菜素引起Caspase信号通路中Caspase-3、6蛋白表达增加有关。其具体的分子机制还需要未来做出更深入的临床前药理学研究，但是本研究仍为芹菜素应用于临床抗乳腺癌治疗提供了应用前的理论依据。

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[2] Sung B，Chung HY，Kim ND. Role of Apigenin in Cancer Prevention via the Induction of Apoptosis and Autophagy [J]. J Cancer Prev，2016，21(4):216-226.

[3] Guzel A，Aksit H，Elmastas M，etal. Bioassay-guided isolation and identification of antioxidant flavonoids from Cyclotrichium origanifolium (Labill.) Manden and Scheng [J].Pharmacogn Mag，2017，13(50)：316-320.

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StudyonapigenininducedapoptosisofhumanbreastcancercelllineMDA-MB-231

Sun Xiaoli，Zhai Hongjun，Zhang Xinwu，et al.

Department of General Surgery， The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710004 )

Objective: To study the apigenin induced apoptosis of human breast cancer cell line MDA-MB-231 and its mechanism. Methods: Conventional culture human breast cancer cell line MDA-MB-231. The cells in logarithmic phase were divided into 40，80，160 μmol/L apigenin group and control group，and treated with 40，80，160 μmol/L apigenin and saline respectively. After 24 and 48 h treatment，cell proliferation was measured using the MTT assay to detect every group. Flow cytometry was used to detect the rate of apoptotic and cell cycle for MDA-MB-231 cells after treated with 40，80，160 μmol/L apigenin and saline for 48 h. The protein expression of Pro-Caspase-3，Caspase-3 and Caspase-6 were detected by Western blot in every group after 48 h treatment. Results: MTT and flow cytometry assay showed that both 80，160 μmol/L apigenin treated group significantly inhibit the proliferation of MDA-MB-231 cells after 24，48 h，and the inhibition of 160 μmol/L treated group was stronger than 80 μM treated group. 50 μmol/L apigenin treated group had an inhibitive effect compared with the control group，but there was no significant difference. Western blot revealed that the expressions of Caspase-3 and Caspase-6 were up-regulated with the increased of apigenin concentration，as well as the expression of Pro-Caspase-3 was decreased. Conclusion: Apigenin exhibits an inhibitory effect of the proliferation and promote apoptosis of MDA-MB-231 cells.The mechanism may be associated with the activation of Caspase-3，6 signaling pathway.

Breast neoplasms Cell proliferation Apoptosis @Apigenin

*陕西省自然科学基础研究计划项目(2015JM8430)

乳腺肿瘤 细胞增殖 细胞凋亡 @芹菜素

R737.9

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.005

(收稿：2017-03-22)