法舒地尔对HL-60细胞增殖、凋亡、分化及侵袭作用的影响*

贾少勋，茹杏丽，王 一

陕西省人民医院血液内科(西安710068)

△通讯作者

法舒地尔对HL-60细胞增殖、凋亡、分化及侵袭作用的影响*

贾少勋，茹杏丽，王 一△

陕西省人民医院血液内科(西安710068)

目的： 探讨ROCK酶抑制剂法舒地尔对HL-60细胞增殖、凋亡、分化以及侵袭作用的影响。方法： 用台盼蓝拒染实验绘制法舒地尔作用下，HL-60细胞的生长曲线；MTT法检测法舒地尔对HL-60细胞增殖抑制。应用流式细胞术CD11b抗原表达，硝基四唑氮蓝(NBT)还原实验分析法舒地尔对HL-60细胞分化影响。采用AnnexinV/PI双染试剂盒上流式细胞仪测定细胞凋亡。利用Transwell穿孔板法观察法舒地尔对HL-60细胞侵袭力的影响。结果： 法舒地尔抑制HL-60细胞呈浓度和时间依赖性、法舒地尔作用于HL-60细胞12、24、48、72 h的半数抑制浓度(IC50)分别为(89.65±12.45)μmol/L、(69.21±15.48) μmol/L、(65.29±20.31) μmol/L以及(58.54±10.02)μmol/L。法舒地尔诱导HL-60细胞凋亡呈时间和剂量依赖性。法舒地尔可增加HL-60细胞后硝基四唑氮蓝阳性率，上调CD11b单核分化抗原的表达。法舒地尔明显抑制HL-60细胞穿透Transwell小室，侵袭到穿孔膜外。结论：法舒地尔有抑制HL-60细胞增殖、诱导凋亡、促进分化及抑制侵袭等多种抗白血病作用。

法舒地尔是一种ROCK激酶抑制剂，主要作用抑制细胞内ROCK活性，从而抑制血管收缩，临床的主要适应证为蛛网膜下腔出血所致血管痉挛，而ROCK激酶在多种肿瘤细胞中高表达，且影响预后[1-2]。已有的研究提示法舒地尔可诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞细胞侵袭[3-4]。本研究拟观察法舒地尔对白血病HL-60细胞增殖、分化和凋亡的影响，以期将法舒地尔作为抗白血病药物提供实验室依据。

材料和方法

1 主要实验材料 人髓系白血病细胞系HL-60(中国医学科学院血液病研究所王敏教授惠赠)；法舒地尔购于天津红日药业；细胞培养液RP1640及胎牛血清购于美国Gibco公司；小鼠抗人CD11b-PE单抗及IgG-PE对照抗体、凋亡检测试剂盒、Tanswell穿孔板及Annexin V-FADD 凋亡检测试剂盒均为美国B-D公司产品；四唑氮兰(NBT)、佛波醇(TPA)及于噻唑蓝(MTT)均购于美国Sigma公司。

2 法舒地尔对HL-60细胞增殖活性检测 ①锥虫蓝染色活细胞计数：调整HL-60细胞密度为2×105/ml,分别接种于含不同浓度法舒地尔(分别为0、25、50、75、100 μmol/L)培养液中,每瓶含5 ml。培养24、48、72 h,吸取10 μl 0.4%台盼蓝置于EP管中,再吸取90 μl待染色的细胞悬液,混匀静置约3 min后用计数板计数活细胞数。每次每瓶计数3次,实验重复3次,绘制细胞增殖抑制曲线。②MTT法检测法舒地尔对HL-60细胞的半数抑制浓度(IC50)：调整HL-60细胞密度为5×104接种于96孔无菌培养板中，每孔200 μl。实验组和空白组的设置同方法①。每组每个浓度下设3个复孔，实验重复3次。培养24、48、72 h后加10 μl MTT(10 mg/L)，继续培养4 h后离心弃上清液，每孔加入150 μl DMSO终止反应，微振荡后，用全自动酶标仪在570 nm波长处读取吸光度值，计算抑制率并绘制剂量效应曲线，求出法舒地尔对HL-60增殖抑制率、求出细胞的半数抑制浓度(IC50)

3 四唑氮兰(NBT)还原实验 将细胞以1×105ml的密度接种于4个25 cm2培养瓶中，每瓶加细胞悬液5 ml,其中一瓶为对照，其余3瓶分别加入法舒地尔使其细胞悬液中的终浓度分别为0、25、75、100 μmol/L作用96 h后,离心收集细胞,加入终浓度为1.0 mg/ml的NBT和20 ng/ml的佛波醇(TPA),再在培养箱中37℃孵育30 min，甩片机将细胞均匀涂片,光镜下观察并计数200个细胞,细胞被染成蓝紫色的为阳性细胞，计算阳性细胞百分比，实验重复3次。

4 流式细胞仪检测细胞膜上CD11b 流式细胞术检测细胞表面分化抗原：取对数生长期细胞接种于6孔板，HL-60细胞细胞密度为2×105/ml，经25、50、75 μmol/L浓度处理72 h，用1×PBS洗涤2次，再各加入5 μl小鼠抗人CDllb-PE，并以小鼠抗人IgG-PE单克隆抗体为质控对照，室温避光孵育15 min，上流式细胞仪进行检测，实验重复3次，结果取平均值。

5 细胞凋亡率检测 处于对数生长期的HL-60细胞以2×105/ml浓度每孔5 ml培养于6孔板中，将法舒地尔按照0、25、50、75 μmol/L处理6、12、24、48 h，细胞收集离心后用PBS重悬洗涤2次；按照试剂盒

说明，加入10 μl Annexin V的混合物、5 μl FADD,混匀，室温避光反应15 min，上流式细胞仪后检测细胞凋亡率，实验重复3次，结果取平均值。

6 细胞侵袭能力检测 按照产品说明,将直径为8 μm Transwell小室放入24孔培养板中，构建体外的白血病细胞的迁移模型。Transwell小室上室中加入不含血清的RPMI1640重悬，含HL-60细胞浓度为1.0×107/ml的无血清的RPMI1640细胞液100 μl,下室中加入含12%血清的RPMI1640培养液600 μl；上室中分别加入法舒地尔浓度为0、50、100 μmol/L,12 h后计数下室的细胞数，实验重复3次，取平均数。

7 统计学方法 结果通过SPSS 11.5统计学软件分析。均值间比较使用￡检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 法舒地尔对HL-60细胞生长曲线的影响 见图1。不同浓度法舒地尔(0、25、50、75 μmol/L)作用于HL-60细胞24、48、72、96 h均能明显抑制其增殖，随着药物浓度的增大抑制效果逐渐增强，法舒地尔抑制HL-60细胞增殖呈浓度和时间依赖性。

图1 法舒地尔对HL-60 细胞的增殖抑制作用

2 法舒地尔对HL-60 细胞IC50的影响 12、24、48、72 h的IC50值分别为(89.65±12.45)μmol/L、(69.21±15.48) μmol/L、(65.29±20.31) μmol/L及(58.54±10.02)μmol/L，法舒地尔对HL-60细胞的IC50值随时间的延长出现明显降低。

3 法舒地尔对HL-60细胞凋亡的影响 见表1。25、50、75 μmol/L浓度的法舒地尔作用于HL-60细胞6、12、24、48 h均可检测到细胞的明显凋亡，且凋亡呈现明显时间和剂量依赖性结果。

表1 法舒地尔对HL-60细胞凋亡率的影响

注：对照组为0 μmol/L,各实验组与对照组相比，*P<0.05

4 法舒地尔对HL-60细胞分化的影响 法舒地尔对HL-60细胞 NBT还原能力的影响：浓度为25、50、75 μmol/L的法舒地尔处理HL-60细胞72 h可见蓝染细胞百分率(NBT阳性率)为分别为(13.20±3.85)%、(22.7±6.18)%以及(24.84±2.36)% 均显著高于对照组(7.58 ±1.62)%(P<0.05)。法舒地尔对HL-60细胞单核分化抗原CD11b表达的影响：用法舒地尔以25、50、75 μmol/L浓度处理HL-60细胞72 h后CD11b阳性率分别为(17.20±1.31)%,(24.46±2.61)%及(45.43±1.58)%均显著高于对照组(7.17±1.04)% (P<0.05)。

5 法舒地尔对HL-60细胞迁移的影响 用法舒地尔分别以25、50、75 μmol/l浓度处理Transwell小室上室HL-60细胞24 h后结果迁移到下室细胞数随着药物浓度的增大逐渐减少，分别为(4.56±1.08)×105/孔、(3.21±0.29)×105/孔以及(2.59±0.11)×105/孔，对照组下室细胞数为(5.35±0.54)×105/孔，对照组与实验组各组间相比差异具有统计学意义(P<0.05)。

讨 论

本研究观察了法舒地尔对白血病HL-60细胞的增殖、分化、凋亡以及侵袭力的影响。研究结果发现50～100 μmol/L浓度的法舒地尔对HL-60细胞具有明显抑制增殖且呈时间和剂量依赖性，低于此浓度的法舒地尔可有效诱导HL-60细胞凋亡。细胞分化阻滞在白血病的发生中起重要作用，因此诱导细胞分化是白血病治疗重要机制之一，本研究发现法舒地尔作用72 h后，HL-60细胞对NBT还原能力明显增强，同时使明显上调HL-60细胞单核细胞分化抗原CD11b。ROCK活性增强，可使细胞骨架发生变化，从而导致肿瘤迁徙和浸润。有研究结果表明法舒地尔可以有效抑制包括膀胱癌、胶质瘤等肿瘤浸润和侵蚀。通过Tanswell小室模仿白血病浸润模型的建立，本研究结果发现法舒地尔可显著减少HL-60细胞的侵袭。

法舒地尔有减少血管痉挛，而在临床上主要用于蛛网膜下腔出血导致的血管痉挛以及缺血性脑病，有研究结果表明法舒地尔可以有效保护心脏免受蒽环类药物的损害[8]。在急性白血病的化疗中多采用的方案为蒽环类药物联合阿糖胞苷[9]。本研究结果提示法舒地尔可以通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、促进分化以及减少侵袭等多种作用产生明显抗白血病作用。如果将法舒地尔与蒽环类化疗药物联合用于急性白血病的治疗中，有可能在提高白血病疗效的同时，可能明显减少化疗药物对心脏功能的损害。

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Effectsoffasudilonproliferation,apoptosis,differentiationandcellmigrationofHL-60cell

Jia Shaoxun,Ru Xinglin,Wang Yi.

Department of Hematology, Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Objective：To investigate the effect of Rho kinase inhibitor fasudil on proliferation，differentiation ,apoptosis and migration of HL-60 cells. Methods：Cell growth curve was analyzed by trypan blue staining, and the inhibitory effect of fasudil on the proliferation of HL-60 cells MTT assay. The differentiation of HL-60 cells exposed to different concentrations of fasudil was evaluated by expression of CD11b using flow cytometry and NBT reduction test. Cell apoptosis rate detected with AnnexinV/FADD double staining by flow cytometry. Trans well chamber in vitro tumor cell migration model was observed the effects of fasudil on leukemic cell migration. Results ：Fasudil inhibited growth of HL-60 cellsin a time-and dose -dependent manner .When HL-60cells was treated by fasudil at 12h, 24h,48h and 72h , the median inhibitory concentration(IC50)were(89.65±12.45)μmol/L,(69.21±15.48) μmol/L,(65.29±20.31) μmol/L and(58.54±10.02) μmol/L, respectively. Fasudil induced apoptosis of HL-60 cells in time-and-dose effect.Fasudil could upregulate the expression of CD11b of HL-60 cells and increased position of NBT in HL-60 cells .Fasudil reduced Significantly fewer HL-60 cells were migrated into the lower compartment. Conclusion: Fasudil can inhibit the proliferation of leukemic cells and induce HL-60 cells apoptosis, promote the differentiation of leukemia cells, can inhibit leukemic cells distant metastasis.

HL-60 cells Cell proliferation Apoptosis Cell differentiation @Fasudil

*陕西省自然科学基金资助项目(2012JM4050)

HL-60细胞 细胞增殖 细胞凋亡 细胞分化 @法舒地尔

R733

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.003

(收稿：2017-01-20)