汉防己甲素对人绒毛膜癌BeWo细胞凋亡和细胞周期的影响*

方 静,冀 静,安瑞芳

西安交通大学第一附属医院妇产科(西安 710061)

·基础研究·

汉防己甲素对人绒毛膜癌BeWo细胞凋亡和细胞周期的影响*

方 静,冀 静,安瑞芳

西安交通大学第一附属医院妇产科(西安 710061)

目的：探讨汉防己甲素对人绒毛膜癌BeWo细胞株凋亡和细胞周期的影响。方法：以不同浓度的汉防己甲素处理人绒毛膜癌BeWo细胞株24 h，采用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化；Western blot检测p53和p21蛋白的表达。结果：汉防己甲素处理后,BeWo细胞株凋亡细胞的比例明显增高 (P<0.01),细胞周期G0/G1期细胞增加(P<0.01),S期细胞减少(P<0.01),p53和p21蛋白表达水平均升高(P<0.01)。结论：汉防己甲素可以对绒毛膜癌BeWo细胞株发挥诱导凋亡及细胞周期阻滞的作用，有望成为绒毛膜癌化疗方案的辅助治疗药物。

妊娠滋养细胞疾病(Gestational trophoblastic disease,GTD)是一组来源于胎盘滋养细胞的疾病，包括葡萄胎(Hydatidiform mole，HM)，侵蚀性葡萄胎(Invasive mole,IM)、绒毛膜癌(Choriocarcinoma,CC)和胎盘部位滋养细胞肿瘤(Placental site trophoblastic tumor,PSTT)等，后三者为恶性病变，被统为妊娠滋养细胞肿瘤(Gestational trophoblastic tumor,GTT)，其中绒毛膜癌恶性程度极高，在化疗药物问世以前，其病死率高达90%以上，严重威胁育龄期妇女的健康状况[1]。GTT是首个而且唯一一个对化疗药物敏感的实体瘤，有效的化疗使绒毛膜癌的治愈率达到90%[2]，然而仍然有10%的患者对化疗耐药，因此寻求新的治疗药物具有极其重要的意义。汉防己甲素(Tetrandrine,TET)又称粉防己碱，属于双苄基异喹啉类生物碱，自中草药粉防己的块茎中提取。近年来对于膀胱癌、肺癌、肝癌、胃癌和白血病的研究证实，汉防己甲素有抗肿瘤作用，机制可能是抑制肿瘤细胞增殖，诱导凋亡，发生细胞周期阻滞等[3-6]。研究还发现，汉防己甲素可以联合化疗药物，促进化疗效果[7-8]。但是关于汉防己甲素用于绒毛膜癌的治疗效果目前未见报道。本研究中我们采用不同浓度的汉防己甲素处理人绒毛膜癌BeWo细胞株，在不同的时间检测细胞凋亡和细胞周期的变化，同时检测p53和p21蛋白的表达，旨在探讨汉防己甲素对人绒毛膜癌BeWo细胞株凋亡和细胞周期的影响。

材料与方法

1 细胞株和试剂 人绒毛膜癌BeWo细胞株购自ATCC细胞库。胎牛血清购自杭州四季青公司，Ham/F12培养基购自美国Gibco公司。汉防己甲素购自美国Sigma公司，溶于二甲基亚砜(DMSO)中，使用前用培养基稀释至实验所需浓度。p21和p53抗体购自于Santa Cruz生物公司。

2 细胞培养 人绒毛膜癌BeWo细胞株用含15%胎牛血清的Ham/F12培养基,在37℃、5% CO2的培养箱中培养,以1.25 g/L 胰酶和0.2 g/L 乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液消化传代。

3 细胞凋亡检测 取对数生长期的BeWo细胞株，常规消化，制成细胞悬液，以1×107细胞/孔接种于6孔培养板，培养24 h后，更换含有不同浓度汉防己甲素(5、10、20 μg/ml)的培养基，继续培养24 h后收集细胞；以冰磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞，离心，加入1×结合缓冲液400 μl重悬细胞，然后加入Annexin-V-FITC 5 μl，4℃避光放置15 min；加入PI10 μl，4℃避光放置5 min，1 h内上流式细胞仪测定细胞的凋亡率。

4 细胞周期检测 BeWo细胞株种植于6 cm培养皿中,以含不同浓度汉防己甲素(5、10、20 μg/ml)的培养基处理24 h,收集细胞,以70%冰乙醇固定,4 μg/ml PI溶液染色30 min后上流式细胞仪分析结果。

5 Western blot检测 以不同浓度的汉防己甲素(5、 10、 20 μg/ml)处理BeWo细胞株24 h后提取蛋白。12% SDS-PAGE电泳，转膜，5%牛奶室温封闭1 h，加一抗(p21和p53),4℃孵育过夜，二抗孵育1 h后采用化学荧光法显色。GAPDH用做内参。

结 果

1 汉防己甲素对BeWo细胞凋亡的影响 见图1。收集不同浓度汉防己甲素处理24 h的BeWo细胞，通过Annexin V-FITC/PI染色法，检测汉防己甲素处理后BeWo细胞的凋亡情况。在5、10、20 μg/ml汉防己甲素作用24 h后，BeWo细胞凋亡的比例分别为(7.98±2.31)%,(14.74±3.27)%和(28.87±3.69)%，而对照组(0 μg/ml)细胞的凋亡比例为(3.35±0.59)%，差异具有统计学意义(F=48.593，P<0.01)，表明随着汉防己甲素浓度的增加，凋亡细胞的比例也增加。

图1 汉防己甲素对BeWo细胞凋亡的影响

2 汉防己甲素对BeWo细胞周期的影响 见图2。收集不同浓度汉防己甲素处理24 h的BeWo细胞，然后对这些细胞进行流式细胞仪分析。结果显示，汉防己甲素(5、10、20 μg/ml)浓度组作用于BeWo细胞24 h后,细胞在G0/G1期的比率随之增高,阻滞细胞进入S 期,故S期细胞比例下降，与对照组相比差异有统计学意义(FG0/G1=16.486,FS=14.425,P均<0.01)。说明汉防己甲素阻滞细胞在G0/G1期,细胞增殖活动受到抑制。

图2 汉防己甲素对BeWo细胞周期的影响

3 p53和p21蛋白表达的变化 见图3。采用Western blot方法，检测不同浓度汉防己甲素处理24 h后BeWo细胞株中相关蛋白的表达。5、10、20 μg/ml汉防己甲素处理24 h后，p21蛋白表达水平依次为(0.47±0.05)，(0.66±0.07)，(0.85±0.08)，对照组为(0.05±0.01)(F=107.685，P<0.01)；p53蛋白表达水平分别为(0.57±0.06)，(0.83±0.09)，(0.92±0.07)，对照组为(0.31±0.03)(F=51.903，P<0.01)，均明显升高。

图3 p53和p21蛋白表达的变化

讨 论

绒毛膜癌是一种高度恶性的妊娠滋养细胞肿瘤，主要发生于育龄期妇女，其特点是滋养细胞失去原来绒毛或葡萄胎的结构，而散在的侵入子宫肌层，不仅造成局部严重破坏，并转移至其他脏器或组织。自从有效化学药物治疗开始后，绒毛膜癌的病死率由过去的90%逐步下降到10%。也就是说，仍有10%的患者对化疗耐药，针对化疗耐药患者，探索新的二线治疗药物具有极为重要的意义。

我国传统中医药的临床应用由来已久，汉防己甲素就被认为是一种较为安全的中药。最近的研究发现汉防己甲素具有抗肿瘤作用，其抗肿瘤作用的主要机制包括抑制增殖、诱导凋亡和细胞周期阻滞等[9-10]。但是关于汉防己甲素对于人绒毛膜癌细胞株的作用目前尚无人研究。本研究结果发现，汉防己甲素可以诱导绒毛膜癌BeWo细胞株的凋亡，并使细胞周期阻滞在G1期，而且随着汉防己甲素浓度的增加，其效果更加明显，与文献报道一致[10]。研究结果提示汉防己甲素可以通过影响BeWo细胞的凋亡和细胞周期从而抑制肿瘤细胞的生长和增殖，而且汉防己甲素水平在微克范围内已经表现出对绒毛膜癌的治疗具有良好的应用前景。

为了进一步探讨粉防己碱促进绒毛膜癌细胞株凋亡及发生细胞周期阻滞的机制,我们研究了与肿瘤细胞凋亡和细胞周期相关的基因表达水平的变化。p53是一种抑癌基因，作为一个重要的调控因子,p53 蛋白能够抑制肿瘤的生物学行为，抑制肿瘤新生血管的生成，并诱导肿瘤细胞发生凋亡；p53 还可以调控细胞周期,导致肿瘤细胞G0/G1期阻滞[11]。p21 是p53下游的信号分子，p21作为重要的细胞周期调控蛋白，是Cip /Kip家族中的重要成员，可以和大多数Cyclin-CDK复合物结合并使其失活，使Rb 蛋白磷酸化水平下降，非磷酸化的Rb 蛋白在细胞中累积，引起细胞G0/G1期阻滞，阻止细胞进入S期，从而抑制细胞的增殖[12-13]。研究发现，在结肠癌HCT116细胞中，汉防己甲素可以诱导p53和p21的活化，并最终诱导细胞凋亡[14]。本研究结果发现汉防己甲素使BeWo细胞株p53和p21蛋白表达水平上调，提示汉防己甲素可能通过调控上述基因而诱导绒毛膜癌细胞株凋亡及细胞周期阻滞。

综上所述，本研究表明汉防己甲素在微克水平即可以对绒毛膜癌BeWo细胞株发挥诱导凋亡及细胞周期阻滞的作用，这一作用可能是通过上调p53和p21蛋白表达水平来实现的。本研究为绒毛膜癌治疗提供了新的思路，汉防己甲素有望成为绒毛膜癌化疗方案的辅助治疗药物，用于绒毛膜癌的治疗。

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EffectsofTetrandrineonapoptosisandcellcycleofhumanchoriocarcinomaBeWocells

Fang Jing, Ji Jing, An Ruifang.

Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710061)

Objective: To study the effects of Tetrandrine on apoptosis and cell cycle of human choriocarcinoma BeWo cells. Methods: BeWo cells were treated with various concentrations of Tetrandrine for 24 h. Flow cytometry was used to analyze the apoptosis and cell cycle. Western blot was used to detect the expression of p53 and p21. Results: After treatment of Tetrandrine, the apoptosis rate of BeWo cells was increased significantly (P<0.01). The G0/G1phase cell increased, and the S phase cell decreased (P<0.01). The expression of p53 and p21 were increased (P<0.01). Conclusion：Tetrandrine can induce apoptosis and cell cycle arrest in human choriocarcinoma BeWo cells. It can be further used as an adjuvant agent for choriocarcinoma chemotherapy.

Choriocarcinoma Apoptosis Cell cycle @Tetrandrine

*陕西省国际科技合作与交流计划项目(2013KW-27-01)

中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(XJJ2015094)

绒毛膜癌 细胞凋亡 细胞周期 @汉防己甲素

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.001

(收稿：2017-01-03)