薄层色谱-生物自显影技术在活性物质筛选中的应用

丁晓艳，赵英博，王伟杰，白聪聪，关佩沛

薄层色谱-生物自显影技术在活性物质筛选中的应用

丁晓艳，赵英博，王伟杰，白聪聪，关佩沛*

薄层色谱-生物自显影技术(TLC-bioautography)将薄层色谱分离和生物活性测定相结合，是一种活性指导下的快速靶向追踪分离、筛选活性成分的方法。此法操作简单、耗时短、灵敏度和专属性高，常应用于抗细菌、抗真菌、抗氧化，以及对乙酰胆碱酯酶抑制剂、葡萄糖苷酶抑制剂等活性天然产物的筛选。笔者对薄层色谱-生物自显影技术在活性物质筛选方面的应用进行综述。

薄层色谱-生物自显影；抗菌；胆碱酯酶抑制活性；抗氧化；葡萄糖苷酶抑制活性

0 引言

薄层色谱-生物自显影技术(TLC-bioautography)是上个世纪60年代发展起来的一种将现代色谱技术和生物技术结合在一起的快速寻找天然活性化合物的方法。活性成分可在薄层板上直接显现肉眼可见的斑点，可从粗提物中直接筛选出活性成分，是一种活性指导下的快速靶向追踪分离、筛选活性成分的方法。传统的从天然产物中分离活性成分的方法首先要分离出天然产物中的化合物，然后筛选各化合物的活性，经常会出现分离出的化合物为非活性物质或者化合物的量不足以进行大量活性筛查的情况。而TLC-生物自显影技术可使样品分离、定位和活性评价一次完成，在活性指导下进行分离可以减小化合物分离的盲目性，大大缩短活性成分的分离时间。该法具有操作简单、耗费低、灵敏度和专属性高等优点，在天然产物分离和活性物质筛选中得到了广泛的应用[1]。TLC-生物自显影技术最初用于抗菌活性成分的筛选[2-3]，后来逐渐被应用于抗氧化、胆碱酯酶抑制活性、葡萄糖苷酶抑制活性、脂酶抑制活性等方面的筛选，笔者就TLC-生物自显影技术在天然产物活性成分筛选方面的应用进行综述。

1 TLC-生物自显影对抗菌活性的筛选

应用TLC-生物自显影进行抗菌活性的筛选是TLC-生物自显影技术应用最早的方面，也是迄今应用最多、最广泛的方法。其基本原理是利用薄层板将混合物展开，然后将薄层板与接种了细菌或真菌的培养基相接触，在适当的条件下培养，无抗菌活性的部位会被生长出的病原微生物所覆盖，通过加入四唑盐等染色而呈现背景色，而有抗菌活性的部位因抑制了细菌或真菌的生长而呈现抑制斑点，这样就可从混合物中筛选出活性成分[2-3]。常用的四唑盐有噻唑蓝(MTT)、对碘硝基四唑紫(INT)、氯化三苯四氮唑(TTC)等。

TLC-生物自显影技术用于抗菌活性筛选主要有3种形式，即琼脂扩散生物自显影法[4](Agar-diffusion bioautography)、琼脂覆盖生物自显影法[5](Agar-overlay bioautography)和直接生物自显影法[6](Direct bioautography)。前2种方法存在灵敏度低等缺点，应用受到一定限制，而直接法中化合物分离、预处理、培养及自显影都直接在薄层板上进行，是现在应用最多的生物自显影方法。

应用TLC-生物自显影方法可以指导从来自植物提取物或微生物代谢产物中分离具有抗菌活性的化合物，根据TLC-生物自显影的结果，可对提取物各部分的生物活性进行评估，进而有目的地进行下一步的提取分离。部分利用TLC-生物自显影技术筛选天然产物中抗菌活性成分的应用情况见表1。

2 TLC-生物自显影对葡萄糖苷酶抑制剂的筛选

葡萄糖苷酶的作用是水解葡萄糖苷键释放出葡萄糖，是生物体糖代谢途径中不可或缺的一类酶。近年来，葡萄糖苷酶抑制剂的筛选受到广泛关注，因为α-葡萄糖苷酶抑制剂可以减慢小肠中淀粉类物质分解为葡萄糖的速度，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖，可以成为有效的2型糖尿病的治疗药物。Salazar等[11]首先将TLC-生物自显影技术应用于β-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选，其以七叶苷为酶底物，FeCl3为染色剂，在薄层板上，有β-葡萄糖苷酶抑制剂活性的部位显示白色斑点，而其他无活性部位显示深棕色背景。但是这一方法采用植物提取物作为酶底物，具有一定的局限性。

Simões-Pires等[12]在此基础上，建立了专属性更强的TLC-生物自显影方法用于α-和β-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选。其方法是将待测植物提取物在薄层板上展开后喷上α-(或β-)葡萄糖苷酶，孵育后喷2-萘基-α-D-吡喃葡萄糖苷(或2-萘基-β-D-吡喃葡萄糖苷)与固蓝(Fast Blue Salt)的混合溶液，2～5 min后即可显色。其原理是α-葡萄糖苷酶可以水解酶底物2-萘基-α-D-吡喃葡萄糖苷释放出2-萘酚，2-萘酚与固蓝盐反应生成紫色的重氮盐染料。在薄层板上，有活性化合物存在的部分呈现白色斑点，其他部分形成紫色背景。此法灵敏度较高，化合物环己烯四醇B、粟精胺和米格列醇的检测限可分别低至0.1、0.05、0.005 μg。Theiler等[13]在此方法基础上做了轻微调整，以HPTLC-生物自显影结果为指导，从J.secunda叶子的提取物中快速富集并分离了新的具有α-葡萄糖苷酶抑制剂活性的化合物2-咖啡酰氧基-4-羟基-戊二酸及非对映异构体secundarellone B、C。Yang等[14]也在TLC-生物自显影技术的指导下，从块根糙苏(PhlomistuberosaL.)中分离了20个化合物，其中15个化合物显示了很好的α-葡萄糖苷酶抑制剂活性，其IC50值在0.067～1.203 mmo/L范围内，优于阳性对照药阿卡波糖[IC50值为(3.72±0.113) mmol/L]。

表1 TLC-生物自显影技术应用于抗菌活性物质的筛选

注：“—“未测定

3 TLC-生物自显影对抗氧化剂的筛选

自由基是生物体产生的有害化合物，具有强氧化性，可损害机体的组织和细胞，进而引起生物体衰老与疾病。TLC-生物自显影可对天然提取物中具有自由基清除及抗氧化活性的化合物进行筛选。最常应用的显色剂是1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl radical，DPPH)[15-16]，紫色的DPPH可与具有抗氧化活性的化合物结合生成黄色的DPPH-H，在展开的薄层板上喷洒DPPH后，具有抗氧化活性的部位呈现黄色斑点，而其他部位未发生反应，呈现紫色背景。如Gu等[15]以TLC-生物自显影的结果作为指导，从紫苏子(Perillafrutescensvar.acuta)中分离得到4个具有抗氧化活性的化合物，其中迷迭香酸和木犀草素显示了非常显著的自由基清除能力(IC50分别为8.61、7.50 μmol/L)。

为了优化生物自显影在中药研究领域的应用，谷丽华等[17]选择了2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基反应体系，结果显示，在可见光下检视或在734 nm下扫描，薄层板获得明显的蓝色背景色，具有清除ABTS自由基活性的化合物与ABTS+·反应生成无色的ABTS-H而呈现白色斑点。此外，Corsino等[18]用β胡萝卜素检测薄层板上的抗氧化剂，用0.02%的β胡萝卜素二氯甲烷溶液喷洒展开后的薄层板，在自然光照射下即可使薄层板上的背景色褪去，而活性部位仍显黄色。Su等[19]将展开后的薄层板浸在黄嘌呤氧化酶(XO)溶液中孵育，然后再将薄层板浸在含有黄嘌呤和氯化硝基四氮唑蓝的溶液中孵育，具有清除O2·-活性的部位显示白色或黄色条带，而无活性部位显示紫色背景。

4 TLC-生物自显影对胆碱酯酶抑制剂的筛选

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是在世界范围内越来越普遍的老年性疾病，其发病率越来越高，同时愈趋年轻化。目前普遍使用乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂治疗AD，其基础是胆碱能假说。植物是AChE抑制剂的主要来源，采用TLC-生物自显影技术可以高效快速地对植物提取物中具有AChE抑制活性的物质进行筛选。最初使用的是Ellman′s法，以硫代乙酰胆碱(Acetylthio choline)为底物，DTNB[5,5-dithiobis-(2-nitro benzoic acid)]为显色剂[20]，但这种方法的检测灵敏度不高。Marston等[21]以乙酸1-萘酯为酶底物，固蓝B盐为显色剂，可使检测灵敏度提高，是目前比较常用的方法。此方法检测模型药物毒扁豆碱的检测限可低至1 ng，加兰他敏的检测限可至10 ng[21]。Yang等[22]在此基础上做了改进，降低了酶的用量，增加了酶与底物的孵育时间，同时降低显色剂浓度，可将方法的检测限大大降低。用此法测定模型药物石杉碱甲的检测限可低至1×10-10μg，毒扁豆碱的检测限可低至1×10-5μg。Ramallo等[23]将酶液加到琼脂中，可将TLC-生物自显影与MS结合，进一步分析粗提物中活性成分的化学式，从而加速AChE抑制剂的确认，避免了薄层板上离子成分对MS分析的干扰。但是，以上方法只适用于正相薄层板，对于反相薄层板，其表面为疏水性，阻碍了包含酶液和试剂的亲水性层在反相薄层板表面沉积，另外，亲水层和疏水层界面的排斥还降低了化合物的扩散效率。为此，Ramallo等[24]发展了适用于反相薄层板的TLC-生物自显影系统。此法将具有两亲性的三嵌段共聚物Pluronic®加入酶液中，既提高了酶稳定性和重现性，又有助于AChE向非极性的反相板迁移。并且该法以吲哚乙酸酯为酶底物，既可以用荧光法又可以用可见光法检测活性斑点。

5 TLC-生物自显影对脂酶抑制剂的筛选

胰脂肪酶是体内消化三酰甘油的一种重要的酶，抑制胰脂肪酶可以降低小肠中膳食脂肪的吸收效率，从而减轻肥胖。应用TLC-生物自显影技术可以帮助从天然产物中筛选出高效的脂酶抑制剂。Hassan等[25]在之前方法的基础上，建立了用该技术筛选脂酶抑制剂的方法。该法以α-乙酸萘酯为底物，固蓝B盐为显色剂，对阳性对照药物奥利司他的检测灵敏度可低至0.01 μg，对于成分复杂的植物粗提物如野茶树Camelliasinensis(L.) kuntz和迷迭香RosmarinusofficinalisL，当上样量分别达到82 和56 μg时，也可显示出明显的脂酶抑制剂活性。而此法的特异性不强，因此，Tang等[26]发展了一种更稳定可靠、特异性更强的方法，此法采用β-肉豆蔻酸萘酯为底物，更能模拟人的生理过程。Tang等[26]用此法分析了6种纯化合物和3种植物粗提物的脂酶抑制剂活性，其中化合物奥利司他的检测限可达0.01 ng，方法的灵敏度和特异性都显著提高。Bayineni等[27]也建立了一种TLC-生物自显影筛选脂酶抑制剂的方法，该法以p-硝基苯基丁酸酯为底物，溴麝香草酚蓝为显色剂，结果脂酶抑制剂的活性区域会呈现出蓝色斑点，而非活性区域呈现黄绿色的背景。此法对奥利司他的检测限可达1 ng。

6 TLC-生物自显影对酪氨酸酶抑制剂的筛选

酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶，其活性与人的色素障碍性疾病密切相关。酪氨酸酶抑制剂可用于人的色素沉着性疾病，如黑色素瘤、色斑等，也可以用于化妆品的增白剂及果蔬的保鲜等。Wangthong等[28]首先将TLC-生物自显影技术用于酪氨酸酶抑制剂的筛选，此法在展开的薄层板上喷洒酪氨酸酶和L-酪氨酸，具有酪氨酸酶抑制活性的部位会形成白色斑点，而无活性部位则呈棕紫色背景。然而L-酪氨酸水溶性较差，导致反应体系中酶底物不足，而使检测灵敏度降低(阳性对照药曲酸仅为15.6～20.0 ng)。Taibon等[29]将方法改进，直接用水溶性较好的L-DOPA作为酶底物，并进一步在L-DOPA中加入Triton-X100以避免假阳性结果。Zhou等[30]也用L-DOPA作为酶底物，优化了酶和底物浓度、反应温度和时间、反应系统pH值以及薄层板类型等条件，降低了酶使用量，提高了检测灵敏度，阳性对照药曲酸的检测限可低至1 ng。García等[31]用两亲性共聚物凝胶包被的方法，进一步将方法的可用范围扩展到反相薄层板。

7 其他方面的应用

TLC-生物自显影技术因其快速、有效、方便等特点，已在天然药物化学中占有越来越重要的位置。科研工作者还在开发更广泛的TLC-生物自显影技术应用领域。如：Gu等[32]应用TLC-生物自显影方法用于二肽基肽酶Ⅳ抑制剂的筛选，Salazar等[33]应用TLC-生物自显影方法用于沙门氏菌PhoP-PhoQ调节系统抑制剂的筛选等。期待TLC-生物自显影技术有更广阔的应用前景。

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ApplicationofTLC-bioautographyinactivecomponentsscreening

DING Xiao-yan,ZHAO Ying-bo,WANG Wei-jie,BAI Cong-cong,GUAN Pei-pei*

(College of Life and Health Sciences,Northeastern University,Shenyang 110169,China)

TLC-bioautography is a method of fast target tracking,separating and screening of active ingredients,which is based on the combination of thin-layer chromatography with bioactivity assays.This method has the advantages of simple operation,saving time,and high sensitivity and specificity,which is often used in the active components screening of antibacteria,antifungus,antioxidant,cholinesterase inhibitors,glucosidase inhibitiors and others.In this paper,the application of TLC-bioautography in the screening of active substances is reviewed.

TLC-bioautography;Antimicrobial;Cholinesterase inhibition;Antioxidation;Glucosidase inhibition

2017-04-17

东北大学生命科学与健康学院，沈阳 110169

东北大学“大学生创新训练计划”项目(160100)

*

10.14053/j.cnki.ppcr.201710030