脂联素对肾性高血压小鼠心脏的影响

刘 莹

脂联素对肾性高血压小鼠心脏的影响

刘 莹*

目的研究脂联素对肾性高血压小鼠心肌炎症、纤维化与心脏功能的影响，并探讨其作用机制。方法选择脂联素基因敲除纯合子小鼠60只(A组)，野生型小鼠120只(平均分为2组，B组60例，C组60例)，分别制作肾血管性高血压模型(A1、B1、C1)与假手术模型(对照组，A2、B2、C2)，其中C组接受外源性脂联素干预。免疫组织化学染色方法(SP法)检测心肌组织切片中性粒细胞浸润数量，天狼星红(VG)染色法检测心肌胶原沉积纤维化程度，Western blot法检测心肌组织中炎症与致纤维化因子AngⅡ、IL-6、TNF-α、TGF-β水平，ELISA方法检测各组小鼠BNP，观察体外培养心肌细胞在脂联素、AngⅡ干预下的凋亡指数。结果肾性高血压模型组的BNP、心肌中性粒细胞数、心肌胶原及AngⅡ、IL-6、TNF-α、TGF-β水平高于假手术对照组，且A1组高于B1组，B1组高于B2组，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。AngⅡ干预组心肌细胞凋亡指数高于空白对照组、脂联素干预组及共同干预组(P<0.01)。结论脂联素可以通过抗炎症、抗纤维化、抗细胞凋亡的途径保护肾性高血压小鼠的心肌结构与心功能。

脂联素；肾性高血压；炎症； 纤维化； 凋亡

0 引言

心肌纤维化和心功能异常是高血压心肌病的两种重要表现，纤维化主要表现为心肌间质中胶原合成和降解比例失调，沉积增多，排列紊乱，而炎症反应是纤维化的最重要前提[1]。目前，炎症在高血压心肌病中的作用逐渐受到重视，在自发性高血压大鼠中可以观察到炎症反应参与心肌纤维化及血管重构的全过程。脂联素是近年发现的由分化的脂肪细胞分泌的一种特异性蛋白，在细胞葡萄糖和脂肪酸等能量代谢过程中发挥重要的调节作用，并参与细胞增殖肥大和免疫炎症功能的调控[2]。脂联素在血浆中含量丰富，其血浆浓度范围为5～30 μg/mL，约占总血浆蛋白的0.01%。已有研究发现，在C反应蛋白(CRP)升高的人群中，血浆脂联素水平降低，而且低脂联素血症与高CRP血症存在负相关，也有研究报道了血浆脂联素水平与原发性高血压相关联[3]，表明脂联素在炎症反应及高血压的病理过程中表现活跃。然而，脂联素究竟是加重炎症与纤维化的进程，还是发挥抗炎症与纤维化的作用，是通过哪些途径完成此作用的机制，尚不清楚。因此，本研究拟采用脂联素基因敲除小鼠的肾性高血压模型，以及在脂联素干预下培养的小鼠心肌细胞为研究对象，从体内、体外两个层面，明确脂联素对肾性高血压心肌炎症、纤维化与心脏功能的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 脂联素基因敲除纯合子小鼠(Adiponectin-/-) 购于上海南方模式生物研究中心，小鼠心肌细胞株购于上海中乔新舟生物有限公司，兔抗小鼠中性粒细胞ANCA抗体购自博士德生物技术有限公司，检测AngⅡ、IL-6、IL-1β、TNF-α、TGF-β水平的抗体购于Sigma公司，原位末端标记(TUNEL)试剂盒(Roche公司)，脂联素与AngⅡ购于Santa Cruz公司，小鼠BNP检测的ELISA试剂盒购于美国ADR公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及肾性高血压模型的建立 60只8周龄脂联素基因敲除纯合子雄性小鼠(Adiponectin-/-)列为A组；野生型小鼠共120只，分为B组、C组，每组60只。A、B、C组小鼠各组均再随机选30只,共组成6组,即A1、A2、B1、B2、C1、C2组，每组30只。其中，A1、B1、C1组小鼠采用二肾一夹(2K1C)经典造模法，复制肾血管性高血压CKD鼠模型。用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，行腹正中切口切开腹壁，游离左肾动脉并用内径为0.2 mm银夹钳夹，使左肾动脉部分狭窄，右侧肾动脉不触及。A2、B2、C2均为假手术组(对照组)，方法相同，但不安置银夹。术后每周测血压3次，凡术后4周尾动脉收缩压高于20 kPa者确定为高血压形成。C1、C2组小鼠在肾性高血压模型制作成功后，腹腔注射麻醉，在肩胛骨皮下埋藏装有Adiponectin [Sigma，释放速度24 g/(kg·h)微渗泵2MIA型，美国Alza公司]。以上各组均取全部动物30只，2周后断头处死，留取静脉血清与心脏标本检测。

1.2.2 免疫组织化学染色方法(SP法)检测心肌组织切片中性粒细胞 取石蜡切片常规脱蜡，3%H2O2处理20 min，封闭内源性过氧化物酶，PBS洗涤，微波处理20 min，再加10%正常羊血清，置室温20 min后加第一抗体(浓缩型兔抗小鼠中性粒细胞ANCA抗体，购自博士德生物技术有限公司)，工作浓度为1∶100，置室温2 h并于4 ℃过夜，PBS洗涤，加生物素标记羊抗兔IgG室温20 min，PBS洗后加辣根酶标记的链霉卵白素工作液室温20 min，PBS洗涤，DAB显色液显色，苏木素复染。同时磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。免疫组织化学图像分析经标准灰度校正后随机取5个视野(×200倍)，测定阳性细胞的吸光度及面积，用 HPIAS-2000型图像分析软件对切片染色效果进行分析。每个标本随机选取 5 个视野，测定平均光密度值，均值作为标本测定值。

1.2.3 胶原形态定性及定量分析 取左室中段横截面心肌组织，按常规固定，制片后行胶原特异性染色-天狼星红(VG)染色。在VG 染色下,心肌细胞、红细胞呈黄色,胶原呈红色。采用HPIAS-2000型图像分析系统，通过灰度调节来区别胶原与非胶原测量心肌胶原容积分数(Collagen volume fraction，CVF)。计算方法：CVF=胶原面积/总面积，其中胶原面积不包括血管周围胶原面积。随机分析5个视野，取其均值作为该心脏的CVF。

1.2.4 Western blot方法检测心肌组织中AngⅡ、IL-6、TNF-α、TGF-β水平 基本步骤：提取心肌组织总蛋白，蛋白 SDS-PAGE 电泳，蛋白质PVDF电转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入相应的一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温下孵育2 h，ECL 显影。采用生物凝胶电泳图像分析系统(Quantity One 4.62)软件对目的条带进行半定量灰度值分析。

1.2.5 心肌细胞凋亡检测 体外培养的心肌细胞分为4组，A组为空白对照组，B组为脂联素干预组(脂联素30 mg/L)，C组为AngⅡ干预组(AngⅡ10 mol/L)，D组为脂联素与AngⅡ共同干预组。体外采用TDT介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)对凋亡细胞进行原位检测，主要流程：取心肌细胞爬片,以4%甲醛/PBS 于4 ℃冰箱中固定25 min,再浸入0.2% Triton-X-100/PBS 液中,使细胞通透性增强,加用荧光素FITC 标记的核苷酸和脱氧核苷酸末端转移酶(TDT)混合液,于37 ℃作用60 min。在荧光显微镜下观察,以核阳性作为结果判定的标准。与正常细胞比较,凋亡细胞体积变小,胞核浓缩,胞质嗜酸性增强，TUNEL阳性信号为黄绿色或黄色荧光,位于胞核,呈小圆形、环形或新月形，未凋亡的细胞核呈深蓝色。用计算机图像分析系统分析，每组随机取5张细胞爬片，每张爬片随机取10个视野，至少计数1 000个细胞，分别计数每个视野的凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数，计算凋亡指数=(凋亡细胞数/心肌细胞总数)×100%。

1.2.6 ELISA方法检测各组小鼠的BNP 所有研究小鼠断头取血离心后吸取上层血浆,-80 ℃保存待测。用ELISA 竞争性酶免疫分析法测定BNP浓度,试剂盒由美国ADR 公司生产,用Bio-Rad Model 550酶标仪测定。

2 结果

2.1 各组BNP比较 肾性高血压模型组的BNP高于假手术对照组，且A1组高于B1组，B1组高于C1组，差异均有统计学意义(P<0.01)；A2、B2、C2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠 BNP、中性粒细胞ANCA表达阳性单位值、CVF

2.2 各组心肌中性粒细胞数量比较 肾性高血压模型组的心肌中性粒细胞ANCA表达阳性单位值高于假手术对照组，且A1组高于B1组，B1组高于C1组，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，但A2、B2、C2组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.3 各组心肌胶原定量比较 肾性高血压模型组的心肌胶原容积分数(CVF)高于假手术对照组，且A1组高于B1组，B1组高于C1组，差异均有统计学意义(P<0.05)；A2组CVF高于B2、C2组(P<0.05)。见表1。

2.4 各组心肌细胞凋亡指数比较 AngⅡ干预组的心肌细胞凋亡指数高于空白对照组、脂联素干预组及共同干预组(P<0.05)。见表2。

表2 各组心肌细胞凋亡指数的变化

2.5 各组心肌各种炎症介子、纤维化因子半定量比较 肾性高血压模型组AngⅡ、IL-6、TNF-α、TGF-β水平均高于假手术对照组，且A1组高于B1组，B1组高于C1组，差异均有统计学意义(P<0.05)；A2组上述指标高于B2、C2组，B2组的TGF-β水平高于C2组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

3 讨论

国际上普通人群慢性肾脏病(CKD)的患病率为10%～16%，中国城市的CKD患病率为10.3%～12.1%，CKD患者绝大多数合并肾病性高血压，高血压又再次加重肾脏与心脏的损伤，形成恶性循环[4]。慢性心肌病(CVD)是肾病性高血压发展的必然阶段，可见肾病性高血压是重大的公共卫生问题，是对公共卫生资源的巨大挑战，如何防治肾病性高血压造成的心肌损伤意义重大。

心肌纤维化是由于细胞外基质尤其是胶原纤维增加而引起的心肌损害的病理过程，是心功能下降的直接因素[5]。心肌纤维化多发生在左心室，导致心脏顺应性降低，最终导致心力衰竭。国外研究发现，在高血压大鼠心肌的巨噬细胞、CD4 T淋巴细胞、CD8 T淋巴细胞和MHC-Ⅱ表达细胞与成纤维细胞共存，分布密度高于对照组[6]，因此，推测中性粒细胞、TNF-α、IL-6、TGF-β、AngⅡ等具有强烈导致炎症与纤维化的细胞与细胞因子在肾病性高血压心肌中表达明显。

表3 各组心肌中AngⅡ、IL-6、TNF-α、TGF-β水平比较

IL-6是淋巴细胞分泌的具有诱导免疫与炎症反应的细胞因子，可能通过激活核因子，启动促炎症与纤维化基因的表达。TNF-a 可以促进胶原的合成和成纤维细胞前胶原mRNA的转录，通过增加MMP活性和抑制TIMP而促进组织纤维化，TNF-α也可以促进成纤维细胞AT1表达上调，而且加重AngⅡ引起的组织纤维化[7]。TGF-β能够促进胶原的合成，通过增加成纤维细胞胶原的转录和稳定前胶原mRNA，使胶原合成增多，是目前发现的最强大的致纤维化因子。AngⅡ不仅具有强烈的缩血管、升高动脉血压的作用，而且通过其受体在影响细胞生长、增殖、凋亡和调节炎症反应、组织纤维化、凝血机制等方面起着重要的病理生理作用，特别是在高血压左室重构的进展中起重要作用[8]。

BNP是一种由32个氨基酸残基构成的多肽类激素，其氨基端第7 位和第23 位氨基酸残基为BNP 的功能域。BNP主要来源于心室，其含量与心室的压力、呼吸困难的程度、激素调节系统的情况相关[9]。心室的体积和压力增高会导致血浆内BNP的升高，而其升高的程度与心室扩张和压力超负荷的程度呈正比，BNP 水平越高，表示患者心衰程度越严重。

脂联素是最近发现的一种由脂肪组织分泌的胶原样蛋白质，在细胞葡萄糖和脂肪酸等能量代谢过程中发挥重要的调节作用，并参与细胞增殖肥大和免疫功能的调控。脂联素在血浆中含量丰富，已有研究显示，脂联素具有抗糖尿病、抗动脉粥样硬化、抗炎等作用,具体作用机制尚不清楚，特别是对慢性肾病肾性高血压患者发展成心血管疾病的干预作用，国内外报道很少。本研究通过体内与体外两个途径，证实了脂联素通过减少中性粒细胞对心肌浸润，降低TNF-α、IL-6、TGF-β、AngⅡ等致心肌炎症与纤维化因子水平的途径，发挥减轻心肌炎症与纤维化的作用；同时可显著降低心肌细胞凋亡，防止心室重构，保护心功能，是保护心肌的新的治疗手段。脂联素来源广泛，价格低廉，毒性低，易于推广[10]，脂联素心脏保护作用确切、明显，预计对改善CKD、CVD患者生存预后，减轻政府巨大的卫生开支，都有重要的社会效益与经济效益。

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Effectsofadiponectinontheheartofmicewithrenovascularhypertension

LIU Ying*

(Department of Cardiology,the People′s Hospital of Liaoning Province,Shenyang 110016,China)

ObjectiveTo investigate the effects of adiponectin on myocarditis,fibrosis and cardiac function of mice with renal hypertension and explore its mechanism.MethodsAdiponectin knockout homozygous mice (group A,n=60) and wild-type mice (n=120,60 mice in group B,60 mice in group C) were chosen to establish renovascular hypertension models (group A1,group B1 and group C1) and sham operated models(control group:group A2,group B2 and group C2),and mice in group C were treated with exogenous adiponectin.Immunohistochemical staining (SP) was used to detect the number of neutrophil infiltration in myocardial tissue sections.The degree of myocardial collagen deposition and fibrosis was detected by Sirius red (VG) staining.The levels of AngⅡ,IL-6,TNF-α and TGF-β in myocardial tissue were detected by Western blot,and the BNP was detected by ELISA.The apoptotic index of cultured cardiac myocytes under the influence of adiponectin and AngⅡ was measured.ResultsThe number of myocardial neutrophil,quantity of myocardial collagen and the levels of serum BNP,AngⅡ,IL-6,TNF-α and TGF-β in renal hypertension model group were higher than those of control group (P<0.05 orP<0.01),and the sequence from high to low was group A1,group B1 and group C1 (P<0.05 orP<0.01).The apoptosis index of myocardial cell in AngⅡ intervention group was higher than that of control group,adiponectin intervention group and combined intervention group (P<0.01).ConclusionAdiponectin can protect the cardiac structure and function of mice with renal hypertension by activities of anti-inflammation,anti-fibrosis and anti-apoptosis.

Adiponectin;Renal hypertension;Inflammation;Fibrosis;Apoptosis

2016-12-09

辽宁省人民医院心内科,沈阳 110016

沈阳市科技局人口与健康科技攻关专项(2015)

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10.14053/j.cnki.ppcr.201710005