HPLC波长切换法同时测定参芪膏中6个主要成分的含量

朱兰平，庄 欢，余 妹

HPLC波长切换法同时测定参芪膏中6个主要成分的含量

朱兰平1，庄 欢2，余 妹3

目的建立HPLC波长切换法同时测定参芪膏中党参炔苷、丁香苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的含量。方法采用Zorbax XDB-C18色谱柱(4.6 mm× 250 mm，5.0 μm)，以乙腈-甲醇(9∶1)(A)-0.1%甲酸溶液(B)为流动相，进行梯度洗脱，流速0.9 mL/min，柱温30 ℃，进样量为10 μL，检测波长：266 nm(党参炔苷、丁香苷)、254 nm(毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素)。结果党参炔苷、丁香苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素6个成分分别在15.49～309.80、2.15～43.00、5.66～113.20、4.89～97.80、3.28～65.60、12.06～241.20 μg/mL范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系，相关系数分别为0.999 7、0.999 2、0.999 5、0.999 3、0.999 6、0.999 9；平均加样回收率及相应的RSD分别为98.07% (0.61%)、99.09% (1.53%)、99.44% (1.33%)、97.86% (1.28%)、99.95% (1.04%)、97.19% (0.58%)。结论所建立的方法快速，灵敏度高，准确度高，专属性好，为参芪膏的质量控制提供依据。

参芪膏；党参炔苷；丁香苷；毛蕊异黄酮苷；芒柄花苷；毛蕊异黄酮；芒柄花素；波长切换法；多组分测定

0 引言

参芪膏为党参、黄芪2味中药材加工而成的煎膏剂，收载于《卫生部颁药品标准》中药成方制剂第17册。该制剂的标准仅规定了性状和黄芪薄层色谱鉴别，未对成分进行定量测定[1]，且目前尚无关于该制剂多组分定量测定的文献报道。本文建立了一种较为简便的HPLC波长切换法，对参芪膏中2味中药材中的6种指标性成分(党参中的党参炔苷和丁香苷，黄芪中的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素)的含量进行了测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100 系列四元梯度泵高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；分析天平(十万分之一，赛多利斯)；超声波清洗机(SB-5200DTN型，宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 试剂与试药 党参炔苷对照品(批号：111732-201206，含量100.0%)、丁香苷对照品(批号：111574-201504，含量94.9%)、毛蕊异黄酮苷对照品(批号：111920-201505，含量97.1%)、芒柄花素对照品(批号：111703-201504，含量100.0%)来源于中国食品药品检定研究院；芒柄花苷对照品(批号：486-62-4，含量98.0%)来源于上海樊克生物科技有限公司；毛蕊异黄酮对照品(批号：20575-57-9，含量98.0%)来源于上海纯优生物科技有限公司；参芪膏(每瓶装300 g，批号：d15070012、16030002、16040007)来源于太极集团重庆桐君阁药厂有限公司。乙腈和甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，甲酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 分别精密称取各对照品适量，用甲醇分别溶解并稀释制成含党参炔苷、丁香苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素各3.098、0.430、1.132、0.978、0.656、2.412 mg/mL单一成分的对照品储备液；再精密吸取适量，用甲醇稀释成浓度为0.154 9、0.008 6、0.056 6、0.048 9、0.032 8、0.120 6 mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 取参芪膏约3.0 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加入甲醇适量，超声提取40 min，放冷，用甲醇稀释至刻度，振摇均匀，过滤，取续滤液，即得参芪膏供试品溶液。

2.1.3 阴性样品溶液 按《卫生部颁药品标准》中药成方制剂第17册参芪膏[1]质量标准项下的处方和生产工艺，分别制备不含党参的阴性样品和不含黄芪的阴性样品，再按照上述方法制备各阴性样品溶液。

2.2 色谱条件 采用Zorbax XDB-C18色谱柱(4.6 mm× 250 mm，5.0 μm)；流动相A：乙腈-甲醇(9∶1)，流动相B：0.1%甲酸溶液，梯度洗脱[2-5](0～9 min，16.0%A；9～15 min，16.0%A→28.0%A；15～30 min，28.0%A→55.0%A；30～35 min，55.0%A→16.0%A)；0～15 min时在266 nm[6]波长下检测党参炔苷和丁香苷，15～35 min时在254 nm[7-8]波长下检测毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素；流速：0.9 mL/min；柱温：30 ℃；进样量为10 μL。

2.3 专属性试验 精密吸取“2.1”项下制备的4种溶液各适量，依法检测，结果显示，各阴性样品溶液的色谱图中，在混合对照品溶液和供试品溶液所测党参炔苷、丁香苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素6个成分对应的位置无干扰，理论塔板数均>3 500。色谱图见图1。

2.4 线性范围考察 分别精密吸取对照品储备溶液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分别用甲醇稀释至20 mL，振摇均匀，即得到6个系列浓度的混合对照品溶液，按照“2.2”项下色谱条件进行测定，分别以各成分质量浓度C为横坐标、峰面积A为纵坐标，建立标准曲线，得回归方程，如表1所示。

2.5 精密度试验 取上述混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，连续进样 6 次，测定峰面积，结果党参炔苷、丁香苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素峰面积的RSD(n=6)分别为 0.77%、1.35%、1.01%、1.06%、1.13%、0.93%。

图1 样品(A)、对照品(B)、党参阴性(C)、黄芪阴性(D)色谱图

2.6 重复性试验 取参芪膏样品(批号：15070012) 6份，按“2.1.2”的方法制备供试品溶液，依法测定，分别计算党参炔苷、丁香苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的含量及RSD，结果各组分的含量依次为1.513、0.065、0.517、0.381、0.295、1.179 mg/g，RSD依次为1.32%、1.04%、1.63%、1.49%、0.56%、1.24%。

2.7 稳定性试验 取供试品溶液(批号：15070012)，在室温下放置0、2、4、6、8、12、18、24 h后进样测定，依法测定党参炔苷、丁香苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的峰面积值，其RSD分别为0.88%、1.23%、1.11%、1.04%、1.03%、0.97%。结果表明，参芪膏供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验 分别精密称取各对照品，用甲醇分别溶解并稀释制成含党参炔苷、丁香苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素为0.451、0.197、0.389、0.286、0.221、0.355 mg/mL的对照品溶液，备用。取批号为15070012的参芪膏6份，每份约1.5 g，精密称定后，置于25 mL的量瓶中，精密加入上述备用对照品溶液各5.0、0.5、2.0、2.0、2.0、5.0 mL，再加甲醇适量，超声提取40 min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，即得参芪膏加样回收样品试液，依法测定，计算6种成分的回收率及RSD，结果见表2。

2.9 参芪膏样品测定 取3批参芪膏，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按“2.2” 项下色谱条件测定党参炔苷、丁香苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素含量，见表3。

表1 线性关系实验结果

表2 加样回收率试验结果

续表

表3 含量测定结果[含量mg/g，RSD(%)]

3 讨论

3.1 样品处理方法的考察 在供试品溶液制备实验过程中，笔者考察了参芪膏供试品制备用不同的提取溶剂(乙醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇)和不同提取时间(20、40、60 min)对参芪膏所测成分的影响，以所测各成分的提取率为指标，优选最佳的样品处理方法。从实验结果来看，采用甲醇提取40 min和甲醇提取60 min，所测各成分提取率相当，考虑到操作的便捷性，最终优选参芪膏供试品溶液制备的溶剂和时间为甲醇提取40 min。

3.2 流动相的考察 在实验中，对梯度洗脱用流动相体系进行了对比考察，选取甲醇-水流动相体系、乙腈-水流动相体系[2]、乙腈-甲醇-水流动相体系[3]分别进行试验，以所测6种成分的分离效果及峰形等为指标，结果表明乙腈-甲醇-水流动相体系优于甲醇-水流动相体系和乙腈-水流动相体系，但毛蕊异黄酮的分离度欠佳，在此基础上，又分别考察了乙腈-甲醇(9∶1)-0.1%甲酸溶液、乙腈-甲醇(9∶1)-0.1%磷酸溶液流动相体系，结果表明，以乙腈-甲醇(9∶1)-0.1%甲酸溶液按照文中规定的梯度洗脱程序作为流动相时，所测各成分均能有效分离，峰形对称，基线较平稳。故优选乙腈-甲醇(9∶1)-0.1%甲酸溶液为流动相体系。

3.3 暂定含量限度的确定 根据本文所测各成分含量平均值约为80%，暂定本品每1 g含党参以党参炔苷计，不得低于1.2 mg，以丁香苷计，不得低于0.05 mg；含黄芪以毛蕊异黄酮苷计，不得低于0.4 mg，以芒柄花苷计，不得低于0.3 mg，以毛蕊异黄酮计，不得低于0.2 mg，以芒柄花素计，不得低于0.9 mg。

4 结论

高效液相波长转换法同时测定参芪膏中6种主要成分，专属性强、操作简便，样品溶液稳定性好，对参芪膏的质量控制及临床安全应用有重要意义。

[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.卫生部颁药品标准(中药成方制剂第十七册)[S].北京:人民卫生出版社,1998:137.

[2] 刘书斌,张樱山,李硕,等.甘肃不同产地党参中表征成分党参炔苷的含量分析[J].甘肃中医学院学报,2014,31(5):15-19.

[3] 王晓辉,刘涛,李清,等.高效液相色谱法同时测定黄芪中的五种异黄酮类成分[J].色谱,2006,24(5):486-488.

[4] 庞维荣,双少敏,刘养清.RP-HPLC法测定党参内酯和党参炔苷的含量及相关性研究[J].世界中西医结合杂志,2008,3(2):89-91.

[5] 纪松岗,李翔,娄子洋,等.高效液相色谱法测定黄芪中毛蕊异黄酮苷和芒柄花素的含量[J].第二军医大学学报,2006,27(1):81-84.

[6] 陈前锋,邓小艳,祝慧凤.HPLC法测定不同产地党参中党参炔苷和丁香苷的含量[J].食品工业科技,2016,37(6):64-67.

[7] 付娟,杨世海,黄林芳.超高效液相色谱法同时测定黄芪中 6 种黄酮类成分的含量[J].中国药学杂志,2013,48(11):916-919.

[8] 梁瑾,刘小花,任远,等.HPLC-DAD-ELSD法同时测定黄芪中5个成分的含量[J].药物分析杂志,2013,33(2):210-213.

Simultaneousdeterminationof6componentsinShenqiGaobyHPLCwavelengthswitchingmethod

ZHU Lan-ping1,ZHUANG Huan2,YU Mei3

(1.Department of Pharmacy,Tinglin Hospital of Shanghai Jinshan District,Shanghai 210505,China;2.Market Supervision and Administration of Shanghai Jinshan District,Shanghai 200540,China;3.Nanqiao Community Health Service Center of Shanghai Fengxian District,Shanghai 201499,China)

ObjectiveTo develop an HPLC wavelength switching method for simultaneous determination of the content of lobetyolin,syringin,calycosin7-O-β-D-glucopyranoside,ononin,calycosin and formononetin in Shenqi Gao.MethodsThe Zorbax XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5.0 μm) chromatographic column was adopted;the mobile phase consisted of acetonitrile-methanol (9∶1) (A)-0.1% formic acid solution (B) with gradient elution at a flow rate of 0.9 mL/min;the column temperature was set at 30 ℃;the sample quantity was 10 μL.The wavelength was set at 266 nm (lobetyolin and syringin) and 254 nm (calycosin7-O-β-D-glucopyranoside,ononin,calycosin and formononetin).ResultsLobetyolin,syringin,calycosin7-O-β-D-glucopyranoside,ononin,calycosin and formononetin had good linearity within the range of 15.49～309.80 (r=0.999 7),2.15～43.00 (r=0.999 2),5.66～113.20 (r=0.999 5),4.89～97.80 (r=0.999 3),3.28～65.60 (r=0.999 6) and 12.06～241.20 μg/mL (r=0.999 9),respectively.The average recoveries and the correspondingRSDwere 98.07% (0.61%),99.09% (1.53%),99.44% (1.33%),97.86% (1.28%),99.95% (1.04%) and 97.19% (0.58%),respectively.ConclusionThe established method is rapid with high sensitivity,accuracy and specificity,which can be applied to the quality control of Shenqi Gao.

Shenqi Gao;Lobetyolin;Syringin;Calycosin7-O-β-D-glucopyranoside;Ononin;Calycosin;Formononetin;Wavelength switching method;Multicomponent determination

2017-02-14

1.上海市金山区亭林医院药剂科，上海 201505；2.上海市金山区市场监督管理局，上海 200540；3.上海市奉贤区南桥镇社区卫生服务中心，上海 201499

10.14053/j.cnki.ppcr.201710022