延胡索酸碱提取物HPLC指纹图谱及主成分分析

金力薇，赵灵佳，岳显可，陈薇娜，钱 敏，杨海燕

延胡索酸碱提取物HPLC指纹图谱及主成分分析

金力薇1，赵灵佳1，岳显可2,3*，陈薇娜3，钱 敏2，杨海燕3

目的建立延胡索不同浓度酸碱提取物的HPLC指纹图谱，并结合主成分分析法(PCA)评价不同提取物中的化学组分。方法用氨水、冰醋酸配制不同浓度酸碱水溶液，供试品加热回流提取；采用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈-0.6%醋酸溶液(pH 5.0)为流动相，进行梯度洗脱，检测波长280 nm，柱温25 ℃，流速1 mL/min，构建HPLC指纹图谱，用相似度软件建立共有峰模式；应用SPSS 19.0分析软件，以主要色谱峰峰面积为变量进行PCA分析。结果标定了延胡索不同酸碱提取物HPLC指纹图谱的16个共有峰，并指认了其中6个共有峰，分别为原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素和紫堇碱，各批次延胡索提取物的相似度在0.861～0.984；PCA结果表明，前3个主成分的累计贡献率达到91.097%；选择这3个因子对延胡索不同酸碱提取物进行综合评价。结论HPLC指纹图谱结合PCA可以快速、客观地评价延胡索不同酸碱提取物的化学组分差异，并确定酸性溶液更适合延胡索生物碱类成分的提取。

延胡索；酸碱水溶液；指纹图谱；主成分分析

0 引言

延胡索为罂粟壳植物延胡索Corydalisyanhusuo的干燥块茎，别名元胡。在传统医学中有两千多年的历史，用于胸痹心痛、脘腹疼痛、腰痛、疝气痛、痛经、闭经、产后瘀滞腹痛、跌打损伤等[1]，为中药复方制剂中的常用药，在神经系统[2]方面具有镇痛[3]、镇静作用，在心血管系统方面有扩张冠脉血管[4]、抗心律失常[5]、保护心肌细胞作用[6]。延胡索多以其醋制品入药，醋制能使难溶于水的生物碱与醋结合成为易溶于水的醋酸盐，从而增加延胡索在水煎液中的总生物碱含量[7]。为进一步分析醋制对生物碱溶出的影响，排除炮制过程中热作用带来的影响，本研究以不同浓度酸碱水溶液为提取溶剂，对生延胡索片进行提取。同时利用HPLC指纹图谱整体、宏观的分析特点[8]，结合主成分分析法，对延胡索不同浓度酸碱提取物中化学组分进行分析。

1 仪器和试药

1.1 仪器 戴安UltiMate 3000高效液相色谱仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)；Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；AL-204电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；DK-98-ⅡA数显电子恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试药 新鲜延胡索药材采自浙江金华东阳，新鲜切片，烘干，为生延胡索片；原阿片碱(批号：110853-201003，纯度99.9%)、盐酸巴马汀(批号：110732-201108，纯度86.2%)、盐酸小檗碱(批号：110713-200910，纯度97.9%)、延胡索乙素(批号：110726-201112，纯度99.6%)购自中国食品药品检定研究院，去氢紫堇碱(批号：141207，纯度98.12%)、紫堇碱(批号：150327，纯度98.56%)购自成都普非德生物技术有限公司；氨水、冰醋酸、甲醇、磷酸、三乙胺为分析纯，液相用甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水。

2 方法

2.1 延胡索饮片的加工 新鲜延胡索采自浙江金华东阳，经浙江中医药大学中药饮片有限公司质检科鉴定为罂粟科紫堇属延胡索(CorydalisyanhusuoW.T.Wang)的块茎，新鲜切片，烘干为生延胡索饮片，备用。

2.2 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；流动相：乙腈A-0.6%醋酸溶液(三乙胺调pH至5.0)B梯度洗脱(洗脱条件：0～50 min，15%～50%A；50～70 min，50%～80% A；70～75 min，80% A)；检测波长：280 nm。色谱图见图1。

图1 延胡索混合标准品HPLC色谱图

2.3 对照品溶液的制备 称取对照品原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素、紫堇碱适量，于20 mL量瓶中，加甲醇至刻度，溶解摇匀，制成含原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素、紫堇碱浓度分别为286.71、252.14、256.01、244.32、306.27、228.17 μg/mL的混合对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备 称取延胡索粉末(过三号筛)约0.5 g，于具塞三角锥形瓶中，精密加入水50 mL，称重，冷浸1 h后加热回流1 h，放冷，再称重，用水补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.5 精密度试验 取同一份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图。以延胡索乙素为参照峰，计算共有模式图谱的相似度分别为0.999、0.998、0.999、0.997、0.998、0.999、0.997，RSD为0.09%，表明精密性良好。

2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h进行检测，记录色谱图。以延胡索乙素为参照峰，计算共有模式图谱的相似度分别为0.996、0.999、0.997、0.998、0.999、0.998、0.999，RSD为0.12%，表明供试品溶液在0～10 h稳定性良好。

2.7 重现性试验 取同一批次延胡索粉末6份，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项下色谱条件进行测定记录色谱图。以延胡索乙素为参照峰，计算共有模式图谱的相似度分别为0.997、0.995、0.996、0.999、0.995、0.996、0.998，RSD为0.15%，表明重现性良好。

2.8 延胡索酸碱提取物指纹图谱建立

2.8.1 指纹图谱的建立 称取延胡索粉末约0.5 g，分别精密加入8.0%、4.0%、2.0%、1.0%、0.5%醋酸溶液，水，0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、8.0%氨水溶液各50 mL，按“2.4”项下方法继续制备供试品溶液。按“2.2”项下色谱条件进行分析，得延胡索不同浓度酸碱提取物指纹图谱。以AIA(*cdf)格式导入国家药典委员会的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”，设定S1为参照图谱，对保留时间的色谱峰进行多点校正和数据匹配，时间宽度为0.1 min，生成叠加图，见图2。

图2 延胡索不同浓度酸碱提取物HPLC指纹图谱叠加图

2.8.2 共有峰标定 根据11批延胡索提取物指纹图谱，利用中药指纹图谱相似度评价系统的数据匹配功能，标定16个共有指纹峰，见图3。并指认3号峰为原阿片碱、9号峰为盐酸巴马汀、10号峰为盐酸小檗碱、11号峰为去氢紫堇碱、12号峰为延胡索乙素、13号峰为紫堇碱，其中延胡索乙素为参照峰。延胡索不同浓度酸碱提取物共有峰相对保留时间与相对峰面积见表1。

图3 延胡索不同浓度酸碱提取物HPLC共有峰模式图

2.8.3 延胡索酸碱提取物指纹图谱相似度评价 S1～S5为延胡索酸提取物，S6为延胡索水提取物，S7～S10为延胡索碱提取物，以共有峰模式图谱为标准，进行整体相似度评价，结果显示，各批次延胡索提取物的相似度在0.861～0.984，具体见表2。

2.9 主成分分析

2.9.1 特征值和方差贡献率 应用SPSS 19.0软件，以主成分特征值及贡献率为依据，对延胡索不同浓度酸碱提取物进行主成分分析。由表3、图4结果可知，其中第1、2、3主成分特征值分别为11.482、2.029、1.064，对应的贡献率分别为71.765%、12.679%、6.652%，累计贡献率为91.097%。

表1 各共有峰相对保留时间和相对峰面积统计表

表2 延胡索不同酸碱溶剂提取物相似度分析

表3 特征值和方差贡献率

图4 碎石图

由表4可知，第1主成分主要反映原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素、紫堇碱和1、4、5、6、7、8号峰的主要信息，第2主成分主要反映2、14、15、16号峰的信息。

以第1、第2、第3主成分为变量得到的三维投影图载荷图(图4)，在投影图中距离原点较远的几个点就是主成分1和2中权重较大的成分，对区分延胡索不同浓度酸碱提取物中起的作用较大。

2.9.2 延胡索酸碱提取物主成分得分、综合得分及排名 以选择的3个主成分贡献率为权重系数，对延胡索不同浓度酸碱提取物进行综合评价，计算主成分得分及综合得分，见表5。其中酸浓度越大，其主成分1得分和综合得分越高，而主成分1主要反映原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素、紫堇碱和成分1、4、5、6、7、8等，说明酸提取物中生物碱类成分丰富且含量高；延胡索水提取物中化学组分及含量较酸提取物低；弱碱溶液抑制延胡索生物碱成分的溶出，然而，随着碱浓度增大，延胡索生物碱溶出先增加后又下降。

表4 成分载荷矩阵

图5 载荷图

表5 延胡索不同溶剂提取物主成分得分、综合得分及排名

3 讨论

不同地区延胡索醋制方法和工艺有一定区别，如醋煮、醋蒸、醋炙，在这个炮制过程中，生物碱含量的变化，除了辅料带来的影响，也不能排除热作用对药材组织的进一步破坏导致化学成分的溶出。本研究以生延胡索片为实验材料，着重考察酸碱度对生物碱溶出的影响。通过HPLC指纹图谱结合主成分分析法，对延胡索不同浓度酸碱提取物的化学组分进行分析，标定了16个共有峰，并指认了原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素和紫堇碱，延胡索不同浓度酸碱提取物的相似度在0.861～0.984；主成分分析筛选了3个主成分，其中第1主成分贡献率为71.765%，第2主成分贡献率为12.679%，第3主成分贡献率为6.652%，进而计算得到主成分得分和综合得分。延胡索在醋酸溶液中的化学成分，特别是生物碱类成分的提取效果较好，也进一步验证了经醋制后，延胡索生物碱与醋酸结合成易溶于水的醋酸盐，从而更好地发挥药效。

近年来，医院、患者服用免煎配方颗粒的比重越来越大。然而，配方颗粒的投料必须是对应的饮片，比如醋延胡索颗粒必须是醋延胡索饮片经提取而得，类似的其他酒制、盐制还很多。如果在提取过程中可以直接用生药和相应的溶剂提取，则可以减少反复加工带来的成分流失，也可以减少工序从而降低成本。本研究结果也为此设想提供初步的数据支持。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部) [S].北京:中国医药科技出版社,2015:139.

[2] 姜海波,王军,苏建华,等.延胡索乙素对小鼠坐骨神经CCI模型背根神经节Cav1.2表达的影响[J].中国药理学通报,2015,31(11):1598-1603.

[3] 冷文婷,王殊秀,冷玉芳,等.延胡索乙素分别与URB597和URB602联合应用对CCI大鼠镇痛作用的研究[J].中国疼痛医学杂志,2012,18(12):735-738.

[4] 俞静,花宝金,朴炳奎.延胡索乙素对放射所致血管内皮细胞损伤的保护作用[J].中华肿瘤防治杂志,2011,18(8):584-587,601.

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[6] 程星烨,石钺.延胡索抗心肌缺血活性部位指纹图谱中化学成分分析[J].中国中药杂志,2008,33(14):1717-1719.

[7] 雷云,李先端,杨洪军,等.基于成分分析和活性评价的延胡索醋制的研究[J].中草药,2013,44(21):2992-2996.

[8] 游修琪,顾雪竹,毛淑杰,等.延胡索产地不同加工品HPLC指纹图谱研究[J].中成药,2009,31(10):1481-1484.

HPLCfingerprintingandprincipalcomponentanalysisofRhizomacorydalisacidandalkaliextracts

JIN Li-wei1,ZHAO Ling-jia1,YUE Xian-ke2,3*,CHEN Wei-na3,QIAN Min2,YANG Hai-yan3

(1.the First People′s Hospital of Wenling,Wenling 317500,China;2.Zhejiang Chinese Medical University Medical Pieces,. LTD,Hangzhou 311401,China;3.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China)

ObjectiveTo evaluate the contents of the chemical composition ofRhizomacorydalisacid and alkali extracts by HPLC fingerprint combined with principal component analysis (PCA).MethodsDifferent concentrations of acid and alkali aqueous solution were made up by ammonium hydroxide and acetic acid.Test sample solution was prepared by heating reflux.The chromatographic conditions were as follows:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),linear gradient elution of acetonitrile-0.6% acetate solution (pH 5.0).The detection wavelength was 280 nm.The column temperature was 25 ℃,flow rate 1 mL/min.The common mode of HPLC fingerprints ofRhizomacorydalisextracts was established with similarity evaluation software.SPSS 19.0 software was used for PCA analysis with the common peaks area as variables.ResultsThe common mode of the HPLC characteristic chromatographic profile was set up with 16 common peaks,and 6 of the common peaks was identified as protopine,palmatine hydrochloride,berberine hydrochloride,dehydrocorydaline,tetrahydropalmatine and corydaline.The similarity ofRhizomacorydalisextracts was 0.861～0.984.The PCA results showed that accumulative contribution of first three factors was up to 91.097%,which were chosen to comprehensively evaluate theRhizomacorydalisacid and alkali extracts.ConclusionHPLC combined with PCA can quickly and objectively evaluate the difference in chemical composition ofRhizomacorydalisacid and alkali extracts,and alkali aqueous solution is more suitable for extractingRhizomacorydalis.

Rhizomacorydalis;Acid and alkali aqueous solution;Fingerprint;Principal component analysis

2017-02-04

1.温岭市第一人民医院，浙江 温岭 317500；2.浙江中医药大学中药饮片有限公司，杭州 311401；3.浙江中医药大学，杭州 310053

杭州市卫生科技计划(一般)项目(2015A39)

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10.14053/j.cnki.ppcr.201710021