环磷酰胺对小鼠免疫抑制作用过程中代谢通路变化的代谢组学研究

师萱，阳勇，秦伟瀚，徐嘉红，杨大坚，郭延垒

(重庆市中药研究院，重庆 400065)

研究报告

环磷酰胺对小鼠免疫抑制作用过程中代谢通路变化的代谢组学研究

师萱，阳勇，秦伟瀚，徐嘉红，杨大坚，郭延垒*

(重庆市中药研究院，重庆 400065)

目的采用代谢组学方法，研究环磷酰胺对小鼠免疫抑制作用过程中代谢通路的变化。方法采用流式细胞术了解免疫细胞变化情况，通过建立偏最小二乘法模型多结果进行判别。以偏最小二乘法模型中变量重要性投影(variable importance in projection，VIP)参数筛选潜在的生物标志物，通过统计分析确定差异性代谢物，借助代谢组学小分子化合物快速鉴定分析软件系统对差异性代谢物进行进一步鉴定分析，通过搜库及运算最终确定差异代谢物质9种，通路富集结果分析差异代谢通路3条。结果环磷酰胺对正常机体的不饱和脂肪酸的生物合成、线粒体脂肪酸代谢、甘油磷脂代谢、甾类激素的生物合成、花生四烯酸代谢、脂肪酸代谢、嘧啶的生物合成等代谢通路均产生明显影响。结论环磷酰胺在正常组与实验组中影响最重要的代谢通路为花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢和嘧啶代谢。

环磷酰胺；免疫抑制；代谢组学；代谢通路

人体依靠由自身细胞免疫和体液免疫组成的强大免疫力，抵御着种类庞大、数量繁多的各种疾病。正常情况下，异体物质侵入机体后，免疫细胞将产生包围、分解、吞噬、消灭和清除作用。但是，过度免疫反应产生的大量免疫细胞和堆积的大量免疫球蛋白，将导致组织损害和器官功能障碍而形成原发性的自身免疫性疾病[1-3]。

环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)作为常用烷化剂类抗肿瘤药物和细胞毒性药物，临床上主要用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病和器官移植等，但是环磷酰胺对免疫功能和造血系统存在抑制作用的不良反应，目前临床尚无有效的防治手段。环磷酰胺对处于有丝分裂循环周期的细胞产生破坏和杀灭作用，因此对活化增殖的细胞具有细胞毒性作用，表现为对免疫相关细胞呈现出较强的免疫抑制作用，所以环磷酰胺在免疫抑制研究中常作为阳性对照物，如对细胞免疫、体液免疫和巨噬细胞活性测定研究[4-6]。

代谢通路的变化研究在疾病发生发展的机制，药物的作用机制研究及阐释中具有重要意义。通过前期研究发现环磷酰胺对小鼠的体液免疫产生明显抑制作用，但是，在体液免疫抑制作用的过程中代谢通路的变化暂无研究。因此，本实验通过环磷酰胺对小鼠的体液免疫产生过程中代谢通路的变化研究，对环磷酰胺在自身免疫性疾病的作用机制等方面的研究具有重要意义[7,8]。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 实验动物

实验采用雄性KM小鼠20只，9周龄，体重(18±3)g，由重庆市中药研究院实验动物中心提供【SCXK(渝)2012-0006】。饲养于重庆市中药研究院屏障环境中【SYXK(渝)2012-000】。

1.1.2 仪器与试剂

Triple TOF 4600高分辨质谱系统(美国AB Sciex公司)；LC-30AD超高效液相系统(日本Shimadzu公司)；CytoFLEX流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)；Microfuge 20R高速冷冻离心机(美国贝克曼库尔特公司)；涡旋振荡器(德国IKA公司)；XS-105十万分之一精密电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX，美国Sigma公司)，甲酸(formic acid，Sigma-Aldrich公司，批号：56302-10ML)，抗体试剂盒(MolCpx FITC MAB 0.5MG 17A2，PERCP-CY5.5 MAB 0.1 MG 1D3；PE MAB 0.2MG GK1.5；CD8A PE-CY5 MAB 0.1MG 53-6.72168；APC MAB 0.1MG 53-7.3；美国BD公司)，水、腈、甲醇均为质谱级(美国Fisher公司)，其他试剂均为市售分析纯。

1.2方法

1.2.1 分组与给药

在SPF清洁级环境中适应性喂养3 d后，将20只小鼠随机分为空白对照组和实验组各10只，每笼5只。实验组按照剂量灌胃给予环磷酰胺20 mg/kg[9]，空白对照组给予同体积的生理盐水。连续给药7 d，每天称重，于第8天取全血于EP管中，静置后离心取血清备用[10,11]。

1.2.2 全血检测

另取全血，采用流式细胞仪检测T、B细胞及亚群等指标，包括CD3+/CD8+、CD3+/CD4+、CD19+/CD5+、CD19-/CD5-、CD19+/CD5-、CD3+等指标。

1.2.3 血清样品处理及QC样品制备

精密吸收小鼠血清样品50 μL置1.5 mL EP管中，加入甲醇150 μL后于涡旋仪上混匀2 min，以12 000 r/min离心10 min，取上清液3 μL进样，进行UPLC/Q-TOF-MS/MS分析。另取处理后样品各20 μL混合后混匀作为QC样品。

1.2.4 Triple TOF 4600高分辨质谱系统的分析条件

系统选用Kinetex XB-C18柱 (100 mm×2.1 mm，2.6 μm)，流动相为含0.1%甲酸的超纯水(A)/乙腈(B)，采用梯度洗脱程序：起始B为10%并持续1.00 min；1.00～8.00 min B变为80%，并持续至12.00 min；12.01 min B变为10%并持续至15.00 min。流速为300 μL/min；柱温为30℃。

Triple TOF 4600高分辨质谱系统采用ESI离子源，分别采用Positive离子化方式和Negative离子化方式；质量扫描范围m/z 100～1000；鞘气为55 Psi，辅助气为55 Psi；气帘气为25 Psi，雾化温度600℃，采用TOF-MS-Product Ion-IDA扫描模式，TOF/MS一级预扫描和触发的二级扫描Product Ion-IDA离子累积时间分别为250、100 ms，采用动态背景扣除(DBS)作为二级触发条件，解簇电压80 V，CE碰撞能量为35 eV，CES碰撞能量叠加为(35±15) eV。

1.3统计学方法

2 结果

2.1全血检测结果

T抑制细胞对体液免疫和细胞免疫起负向调节作用的T细胞亚群，T辅助细胞具有协助体液免疫和细胞免疫的功能。采用流式细胞仪检测T、B细胞及亚群等指标发现，实验组与对照组比较，总T细胞和T辅助细胞上升明显，而T抑制细胞出现下降现象；总B细胞明显降低，同时，B1细胞和B2细胞均出现下降。说明环磷酰胺对T 抑制细胞和T辅助细胞均产生明显影响，同时对B1细胞和B2细胞均产生不同程度影响(如表1所示)。

2.2QC样品检测分析结果

QC样品检测结果主要用于判断样品数据采集过程中仪器的重现性与稳定性。通过连续10次连续进样分析结果可知，UPLC/Q-TOF-MS/MS质谱系统在连续进样中快速平衡，连续进样至第10次重现性良好，适合大批量样品数据采集(如图1所示)。

2.3正常组与实验组代谢组学分析

为了研究将正常组与实验组代谢通路变化，将所得的原始数据通过MarkView软件转化后用进行峰识别、峰对齐、扣除溶剂峰、杂质峰的处理，滤噪等处理，导出的数据表得到由一系列三维矩阵，并进行偏最小二乘法(PLS-DA)分析代谢谱变化，研究发现正常组与实验组存在明显差异(如图2所示,参数见表2)。

表1 流式细胞仪检测结果Tab.1 The results of flow cytometry analysis

注：实验组比对照组，*P< 0.05,**P< 0.01。

Note: Compared with the CON group，*P< 0.05,**P< 0.01.

图1 QC样品重复十次进样的总离子流叠加图Fig.1 The overlay chart of TIC spectra of the QC samples repeated ten times

图2 正负两种离子模式下小鼠血清样品PLS-DA分析后的Score plot图Fig.2 The score plot chart of PLS-DA of mouse serum samples by positive ion and negative ion modes

组别GroupsR2XR2YQ2正离子Positiveion0.5610.9910.938负离子Negativeion0.3540.9170.568

2.4差异物质的解析

正常组与实验组出现明显差异，为了研究造成两组之间的差异性物质，采用PLS-DA模型进一步进行处理。PLS-DA模型中变量重要性投影(variable importance in projection，VIP)参数筛选潜在的生物标志物，VIP值是两组中含量显著改变的差异物质的值，VIP >1，P<0.05时，说明对应的代谢物是差异性代谢物。通过代谢组学小分子化合物快速鉴定分析软件系统(OSI/SMMS，大连达硕信息技术有限公司)对差异性代谢物进行进一步鉴定分析，以MS1和MS2强度(加权法)进行运算最终鉴定代谢物15种。以P<0.05，VIP>1.00为差异物质判断规则，最终确定差异代谢物质9种(如表3)。

2.5差异代谢通路富集分析

作为小分子物质，差异性代谢物在机体内多参与重要功能的调控，为了研究其各自发挥重要作用，借助KEGG网络数据库，找出其具体位置，并对各差异性代谢物相关代谢通路运用Metaboanalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca/)系统进行通路富集，找出通路之间关联，最终确定正常组与实验组代谢通路的差异与关联(如图3所示)。

3 结论与讨论

通过分析发现，环磷酰胺对正常机体的不饱和脂肪酸的生物合成、线粒体脂肪酸代谢、甘油磷脂代谢、甾类激素的生物合成、花生四烯酸代谢、脂肪酸代谢、嘧啶的生物合成等代谢通路均产生明显影响。通过通路富集结果显示，环磷酰胺在正常组与实验组中影响最重要的代谢通路为花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢和嘧啶代谢。

环磷酰胺能抑制免疫细胞，又能抑制骨髓的造血功能，因此对于机体的损害是全身性的毒性作用[12,13]。环磷酰胺对处于有丝分裂循环周期的细胞产生破坏和杀灭作用，因此对活化增殖的细胞具有细胞毒性作用，表现为对免疫相关细胞呈现出较强的免疫抑制作用，所以环磷酰胺在免疫抑制研究中常作为阳性对照物，同时也有报道与代谢组学研究相关研究中。但是对于环磷酰胺对正常机体的相关研究却不是相关研究重点，因此并未引起足够重视。

表3 差异代谢物质鉴定结果Tab.3 Characterization results of the differential metabolites

注：YES为最终确定差异代谢物质，NO为未确定。

Note.“YES”is the metabolic substances for the final differences；“NO”meant not sure.

图3 通路富集分析结果图Fig.3 The chart of pathway view analysis results

在本研究中，环磷酰胺对正常机体产生明显影响，不仅体现在机体生物学生理指标和免疫细胞的变化，还通过代谢组学研究深入到相关作用机制的分子水平变化，对于后期相关研究采用环磷酰胺作为阳性对照物时，提供相关对照研究结果，具有一定的借鉴意义。

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Metabolomicanalysisofthechangesofpathwaysinimmunosuppressivemechanismcausedbycyclophosphamideinmice

SHI Xuan, YANG Yong, QIN Wei-han, XU Jia-hong, YANG Da-jian, GUO Yan-lei*

(Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065, China)

ObjectiveTo investigate the changes of metabolic pathways in the process of immunesuppression in mice caused by cyclophosphamide by metabolomic analysis.MethodsFlow cytometry was used to detect the changes of immune cells, and the results were analyzed using partial least squares model. The potential biomarkers were screened by variable importance in projection (VIP) parameters in the partial least squares model, and the differential metabolites were determined by statistical analysis. The differential metabolites were identified using the metabolomics rapid identification and analysis software. Nine kinds of metabolites were identified by searching and calculation, and result of pathway enrichment showed three differential metabolic pathways.ResultsCyclophosphamide had a significant effect on the biosynthesis of unsaturated fatty acids, metabolism of mitochondrial fatty acids, metabolism of glycophospholipid, biosynthesis of steroid hormones, metabolism of arachidonic acid, metabolism of fatty acids, and the biosynthesis of pyrimidine.ConclusionsThe most important metabolic pathways affected by cyclophosphamide in the normal body are the metabolism of arachidonic acid, glycophospholipid and pyrimidine.

Cyclophosphamide; Immunosuppression; Metabolomics; Metabolic pathway

GUO Yan-lei.Email: guoyanlei1210 @cqacmm.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 05-0539-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.05.013

2017-08-16

重庆市科委应用开发(重大)项目(cstc2014yykfC10004)；(cstc2014yykfC10005)；重庆市科委基本业务费(2016cstc-jbky-01912)；重庆市科委社会事业与民生保障科技创新专项(cstc2017shmsA130090、cstc2017shmsA130035)。

师萱，助理研究员，研究方向：食品科学。 E-mail： shixuan0932@126.com

郭延垒，助理研究员，研究方向：中药药代动力学与代谢组学。E-mail： guoyanlei1210 @cqacmm.com