豚鼠皮肤瘙痒动物模型的建立及评价

米本中，杨武斌，罗晓玲，王旖，胡娟，徐嘉红，樵星芳

(重庆市中药研究院实验动物研究所，重庆 400065)

研究报告

豚鼠皮肤瘙痒动物模型的建立及评价

米本中#，杨武斌#，罗晓玲，王旖，胡娟，徐嘉红，樵星芳*

(重庆市中药研究院实验动物研究所，重庆 400065)

目的通过星点设计-效应平面法优化组胺和4-氨基吡啶(4-AP)联用建模的剂量，旨在建立一种新型的豚鼠瘙痒动物模型。方法用星点设计安排实验，各组分别在脱毛部位皮下注射0.5 mL不同致痒剂，记录豚鼠30 min内的搔抓潜伏期和搔抓次数，用综合评分法筛选最佳致痒组方。通过观察豚鼠的行为学变化和测定血液中的组胺和白介素-6(interleukin- 6，IL-6)的含量对豚鼠模型进行评价。结果行为学实验发现，联合组在30 min内搔抓次数比组胺组和4-AP组均显著增多(P<0.01)，搔抓潜伏期显著缩短(P<0.01)。4-AP组在30 min内搔抓次数比组胺组显著增多(P<0.01)。与对照组相比，联合组、组胺组豚鼠血清的组胺浓度均明显升高(P<0.05或P<0.01)，但联合组升高程度低于组胺组(P<0.05)；与对照组相比，组胺组、4-AP组和联合组的血清IL-6浓度均有显著的升高 (P<0.01或P<0.05)，且联合组明显高于组胺组和4-AP组。病理学检查显示，各模型组均出现不同程度的炎细胞增殖，其中联合组的反应更为明显。结论本试验中优化组方(联合组)模型容易实现并且有良好的重复性。

组胺；4-氨基吡啶；豚鼠；瘙痒模型

瘙痒是皮肤科最常见的症状之一，见于多种皮肤病、胆道疾病、甲状腺疾病、肾脏疾病以及恶性肿瘤等多种临床疾病。目前瘙痒的病理生理学机制尚不完全清楚，临床治疗过程中也缺少理想的止痒药物[1，2]。在瘙痒药物筛选和基础研究的过程中，适当的瘙痒动物模型是评估药效的必要条件。目前瘙痒动物模型多以单一致痒因素建立，如组胺法、4-氨基吡啶法、5-羟色胺法、右旋糖酐法等[3-5]。现有的瘙痒动物模型的方法虽多，但多为单一致痒因素，与临床实际发生瘙痒的多因素性与复杂性区别较大，且批间重复性差，使得药物筛选与基础研究的准确性存在较大的问题。因此建立重复性良好的瘙痒模型成为当前外用止痒药物评估过程中的一大亟待解决的问题。本文拟尝试通过星点设计-效应面法优化组胺和4-氨基吡啶(4-AP)两种致痒物质剂量，通过观察模型搔抓行为学、局部组织变化，ELISA方法检测血清瘙痒相关细胞因子，与传统的单因素致瘙痒模型进行比较，旨在建立一种新型同一性较高的豚鼠瘙痒模型，以满足研究瘙痒发生机制和开发止痒药物的需要。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 实验动物

4周龄普通级豚鼠112只，体重200～250 g，雌雄各半，由重庆市中药研究院实验动物研究所提供【SCXK(渝)2012-0006】。实验动物将饲养在普通级环境中，饲养设施符合普通级实验动物的饲养要求。饲养期间给予豚鼠标准湿颗粒饲料，每天喂一次干草或青饲料。温度：20～26℃。湿度：50%～70%。实验豚鼠饲养及组织取材均于重庆市中药研究院实验动物研究所实验设备内进行【SYXK(渝)2012-0003】。本实验所有操作均符合中华人民共和国《实验动物管理条例》。实验方案已通过伦理审查，重庆市中药研究院实验动物福利伦理审查【渝中药院(2014)71号】。

1.1.2 主要试剂

组胺(histamine)，分子式：C5H9N3，分子量：111.15 g/mol，含量≥97%，产品编号101646111，购自美国Sigma公司；4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)，分子式：C5H6N2，分子量：94.11 g/mol，含量≥99%，产品编号1002408342，购自美国Sigma公司；豚鼠组胺和IL-6检测试剂盒，购自上海笃玛生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1 豚鼠瘙痒模型的制备

适应性饲养5 d后，全部豚鼠颈背部脱毛，暴露约2 cm × 2 cm 皮肤，按体重随机分组。分别在豚鼠的脱毛部位皮下注射致痒剂，给药体积每只0.5 mL。以豚鼠嘴或后肢搔抓注射部位至停止记作1次搔抓(连续搔抓记作1次)。

1.2.2 星点设计-效应面法优化致痒剂的剂量

(1)设计试验

在预试验基础上，以致痒剂组胺(X1)、4-AP(X2)的百分浓度为考察因素。根据星点设计原理，每因素设五水平，用代码值-α，-1，0，1，α表示，因素水平见表1。以30 min内的搔抓潜伏期(注射结束至第1次搔抓开始的时间)和搔抓次数作评价指标，试验安排见表2，每组豚鼠8只。

按公式(a-b)×X=(c-b)×10进行计算(a：最优值；b：最劣值；c：待求组值；X：待求组得分)[6]，将所有指标综合为一个能反映总体效应结果的值，对于搔抓潜伏期，9号试验时间最短，排第一，给10分；7号试验时间最长，排最后，给1分。对于搔抓次数，9～13号试验次数最多，排第一，给10分；7号试验次数最少，排最后，给1分；其他号试验各指标值则由公式(a-b)×X=(c-b)×10进行计算。最后对每号试验的所有指标分数相加得综合评分A值。

表1 星点设计因素与水平Tab.1 Variables and levels of the central composite design

表2 星点试验设计Tab.2 Experimental designs by central composite design-response surface methodology (CCD-RSM)

注：No．9～13为重复试验。

Note. No. 9～13： repeated experiment.

(2)模型拟合与效应面优化

以总评A值为因变量，使用Design-Expert 8.0.6.1对各因素进行多元线性回归和二项式拟合，并进行方差分析。根据回归方程以及拟合的响应曲面形状，分析磷酸组胺和4-AP浓度(w/v)对豚鼠瘙痒模型中搔抓潜伏期及和搔抓次数的影响，并对最佳造模条件进行预测。

(3)最优条件的验证

根据确定的致痒剂最优造模剂量，分别建立8只动物模型，进行验证实验，并将测定的平均结果与拟合方程的预测值进行比较，并计算其相对偏差。验证本实验得到的拟合方程是否具有较好的描述因素。

1.2.3 最佳组方模型的评价

将豚鼠随机分为对照组(生理盐水)、最佳联合组(0.03%组胺 + 0.07% 4-AP)、组胺组(0.03%组胺)和4-AP组(0.07% 4-AP)，每组各10只，给药体积见“1.2.1”。

记录各组豚鼠30 min内的搔抓潜伏期和搔抓次数，行为学变化记录结束后立即心脏采血约每只5 mL，静置至血液分层后离心分离血清。按ELISA试剂盒要求操作检测豚鼠血清中组胺、白介素-6(IL-6)的含量。采血完成后，取各组试验动物注射部位周围皮肤切成小块置于甲醛溶液。将所取注射部皮肤小块进行病理切片并做HE染色，观察皮肤组织有无急性炎症反应，毛细血管通透性是否增加、水肿以及炎性成分的渗出。

2 结果

2.1星点设计试验结果

根据“1.2.2”项下的表2进行试验，试验结果见表3。以总评A值为因变量，使用Design-Expert对各因素进行多元线性回归和二项式拟合，拟合模型如下：多元线性回归方程

Y=18.32470 - 122.53134X1+ 51.45559X2；

二项式拟合方程Y=11.22890 + 225.89505X1+ 130.98160X2-148.39520X1X2-3459.50086X12-902.25555X22。

多元线性回归拟合方程方差分析发现拟合方程概率P>0.05，表明建立的模型不具显著性，r=0.4337较低，表示自变量与因变量之间的线性相关性较差，拟合度和预测性不佳，因此该数学模型不适合。对二项式拟合方程进行方差分析可知(见表4)，因素X1，X2中一次项和二次项均具有显著性差异，说明各具体试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系，模型组具有高度的显著性(r=0.9048)，说明方程拟合度和可信度均良好，可用此模型对豚鼠的造模工艺进行分析和预测。

表3 星点试验设计与结果Tab.3 Experimental designs by CCD-RSM and scoring results

注：每组豚鼠8只，潜伏期和搔抓次数求平均值。

Note.n=8 in each group. The values are averages of latency and scratching frequency.

表4 二项式拟合方程的方差分析Tab.4 Results of variance analysis of quadratic model

2.2效应面优化及预测验证

根据回归方程，作响应曲面图(图1)，根据所拟合的响应曲面形状和已建立的数学模型，分析得到致痒剂最佳剂量为：组胺0.03%，4-AP 0.07%。按最佳条件对6只豚鼠进行造模验证，结果潜伏期平均值为23 s，搔抓次数平均值35次，总评A值18.646，预测值19.329，偏差率-3.66%，说明本实验得到的拟合方程具有较好的描述因素，数学模型可靠，具有良好的预测性。

图1 因素A和B 对A值的三维效应面及等高线的影响Fig.1 Effects of factors A and B on 3-D-response surface and contour map of OD values

2.3行为学实验结果

实验结果用SPSS 19.0软件进行分析，结果如表5。与组胺组和4-AP组相比，联合组在30 min内搔抓次数显著增多(P<0.01)，搔抓潜伏期显著缩短(P<0.01)。4-AP组在30 min内搔抓次数比组胺组显著增多(P<0.01)。

表5 不同建立方法对豚鼠瘙痒模型搔抓行为学的影响Tab.5 Effect of different modeling methods on the quinea pig itching models

注：与组胺组和4-AP组比较，**P<0.01；与4-AP组比较，#P<0.01。

Note. Compared with the histamine group and 4-AP group：**P<0.01；Compared with the 4-AP group：#P<0.01.

2.4血清指标检测

血清检测结果用SPSS 19.0软件分析发现：与对照组相比，联合组、组胺组豚鼠血清的组胺浓度均明显升高(P<0.05或P<0.01)，但联合组升高程度低于组胺组(P<0.05)，见图2；与对照组相比，组胺组、4-AP组和联合组的血清IL-6浓度均有显著的升高(P<0.01或P<0.05)，且联合组明显高于组胺组和4-AP组，见图3。

注：与对照组比较，**P<0.01，*P<0.05。图2 组胺豚鼠瘙痒模型血液中组胺的浓度Note. Compared with the control group：**P<0.01，*P<0.05.Fig.2 Concentration of histamine in the blood of itching model guinea pigs

注：与对照组比较，**P<0.01，*P<0.05。图3 各组豚鼠瘙痒模型血液中白介素-6的浓度Note. Compared with the control group：**P<0.01，*P<0.01.Fig.3 Concentration of IL-6 in the blood of itching model guinea pigs

2.5病理学检查

HE染色镜下观察结果病理检查显示，与对照组相比，联合组出现轻度急性炎症反应，真皮中有少量炎细胞，出现轻度毛细血管扩张、水肿和炎性渗出；组胺组和4-AP组出现轻微急性炎症反应，真皮中偶见炎细胞，轻度毛细血管扩张。综合分析认为联合组致瘙痒模型出现了较明显的急性炎症反应，见图4。

3 讨论

瘙痒模型的建立方法主要有直接使用特定种系动物法、炎症介质刺激法和化学物质刺激法等，其中较为常用的主要是炎症介质刺激法和化学物质刺激法，如组胺致刮伤豚鼠瘙痒模型、组胺致小鼠瘙痒模型、4-AP致小鼠瘙痒模型等[7]。组胺是较早发现的瘙痒介导物质之一，只存在于肥大细胞和嗜碱性粒细胞内，随着这两种细胞的激活，它被释放到细胞外发挥生物学效应，是肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒的标志。在许多过敏性疾病的动物模型建立中组胺被广泛应用[8-10]。由于豚鼠具有自身易致敏的特性被广泛用于皮肤过敏动物模型的建立，其对组胺的敏感性，成为组胺致疹痒模型的首选动物。4-AP是一种钾通道阻滞剂，其作用机制是加入钾通道阻断剂后，促进血管平滑肌细胞去极化，从而激活电压依赖性钙通道开放，导致准跨膜内流增加，引起血管收缩。同时它也具有促肥大细胞释放组胺的作用[11]。目前豚鼠皮肤瘙痒动物模型中最常用的的是表皮擦伤，滴加磷酸组织胺及5-羟基色胺建模的方法，本实验通过对刮伤瘙痒模型进行改进，采用组胺和4-AP联合进行皮下注射造模，建立有多种介导因子共同参与瘙痒模型。

星点设计-效应面优化法是一种多因素五水平的实验设计，常用来进行非线性拟合的优化。通常在最佳条件附近，指标与影响因素之间的关系为非线性，此时不宜用线性方程进行拟合，应选用二次多项式或更高次的多项式进行拟合，可以提高优化效果，其具有精密度高、预测性好、简便等优点，逐渐替代了均匀设计和正交设计在处方优化中的应用[12]。本文采用星点设计法综合考虑组胺、4-AP两因素间的交互作用，并通过效应面法分析得出致痒剂的最佳剂量为0.03%组胺、0.07% 4-AP。研究发现，联合应用组胺和4-AP建立瘙痒模型与对照以及单一因素致瘙痒模型相比，实验豚鼠在30 min内搔抓次数增多，搔抓潜伏期缩短；血清检测的结果显示联合致癌痒模型组的血清组胺、白介素-6的浓度与对照组相比均有显著变化，表明该模型是一种较好的瘙痒动物模型，有望在外用止痒药物的筛选中推广应用。

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Establishmentandevaluationofaguineapigmodelofitching

MI Ben-zhong#, YANG Wu-bin#, LUO Xiao-ling, WANG Yi, HU Juan, XU Jia-hong, QIAO Xing-fang*

(Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Experimental Animal Institute, Chongqing 400065, China)

ObjectiveTo optimize the optimal doses of histamine and 4-aminopyridine (4-AP) in the establishment of guinea pigs models of itching, and to establish a new guinea pig model of itching.MethodsThe central composite design-response surface method was used to arrange the experiment. In the experiment different pruritus agents were hypodermically injection of 0.5 mL in the depilated area, and the scratching incubation period and scratching number in 30 minutes were counted after the injection. The guinea pig itching model was evaluated by observing the behavioral changes of guinea pigs and measuring the levels of histamine and interleukin-6 in the blood.ResultsThe behavioral experiments found that the scratching frequency in the the combination group was significantly higher than the histamine group and 4-AP group (P<0.01). The itching latency of the combination group was significantly shorter than that of the histamine group and 4-AP group (P<0.01). Compared with the control group, the histamine concentrations of the combination group and histamine group were significantly increased (P<0.05 orP<0.01), and the level of the combination group was lower than that of the histamine group (P<0.05). Compared with the control group, the serum IL-6 concentrations of histamine group, 4-AP group and combination group were significantly higher (P<0.01 orP<0.05), and those in the combination group were significantly higher than the histamine and 4-AP groups. Compared with the control group, pathologic examination showed proliferation of inflammatory cells in all model groups, and the reaction of the combination group was more obvious.ConclusionsThe optimal conditions used in this experiment are easy to achieve and have good reproducibility in the establishment of a guinea pig model of itching.

Histamine; 4-aminopyridine; Guinea pig; Itching model

QIAO Xing-fang. E-mail： Email： 745647159@qq.com

2017-05-04

重庆市科技项目(No.2015cstc-jbky-01907，cstc2015shmszx10010)。

米本中(1987-)，男，助理研究员，专业：动物医学。Email： 858885377@qq.com;杨武斌(1986-)，男，硕士，研究方向：中药药理学。Email： yangwubinhome@163.com。#共同第一作者

樵星芳(1980-)，女，副研究员，研究方向：实验动物学。Email： 745647159@qq.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 05-0528-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.05.011

2017-03-28