六味地黄丸含药血清对β-淀粉样蛋白损伤大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的保护作用研究

宋军营，袁 永，王丛笑，张钟允，宫洪涛，张振强*，刘文弟，高爱社

·论著·

·中医·中西医结合研究·

六味地黄丸含药血清对β-淀粉样蛋白损伤大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的保护作用研究

宋军营1，袁 永1，王丛笑2，张钟允1，宫洪涛3，张振强1*，刘文弟1，高爱社4

目的研究六味地黄丸含药血清(MSLDP)对β-淀粉样蛋白(Aβ)25-35损伤大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)的保护作用，探讨六味地黄丸在防治阿尔茨海默病(AD)中的作用机制。方法2012年3月—2013年4月选取SPF级雄性SD大鼠20只，按照随机数字表法将20只雄性SD大鼠分为对照组、给药组，每组10只。制备MSLDP及Aβ25-35母液备用。根据Aβ25-35、MSLDP不同干预浓度将处于对数生长期PC12细胞分为0、10、20、40 μmol/LAβ25-35组和0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP组，另取处于对数生长期PC12细胞分为正常对照组(不加Aβ25-35和MSLDP)、模型组(加入20 μmol/L Aβ25-35制备AD模型)、MSLDP干预组(加入20% MSLDP+20 μmol/L Aβ25-35)，显微镜下观察0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP组及正常对照组、模型组、MSLDP干预组PC12细胞形态。采用 MTT法检测PC12细胞存活率，同上分组方法及步骤采用Western blotting法检测 PC12细胞血管内皮生长因子B(VEGF-B)蛋白表达水平。结果0 μmol/L Aβ25-35组PC12细胞存活率高于10、20、40 μmol/L Aβ25-35组(P<0.05)；10 μmol/L Aβ25-35组PC12细胞存活率高于20、40 μmol/L Aβ25-35组(P<0.05)；20 μmol/L Aβ25-35组PC12细胞存活率高于40 μmol/L Aβ25-35组(P<0.05)。0、10 μmol/L Aβ25-35组VEGF-B蛋白表达水平高于20、40 μmol/L Aβ25-35组(P<0.05)；20 μmol/L Aβ25-35组VEGF-B蛋白表达水平高于40 μmol/L Aβ25-35组(P<0.05)。0%MSLDP组PC12细胞存活率低于2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP组(P<0.05)；2.5%MSLDP组PC12细胞存活率低于5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP组(P<0.05)；5.0%MSLDP组PC12细胞存活率低于10.0%、20.0%、30.0%MSLDP组(P<0.05)；10.0%MSLDP组PC12细胞存活率低于20.0%、30.0%MSLDP组(P<0.05)。20.0%MSLDP组PC12细胞存活率低于30.0%MSLDP组(P<0.05)。显微镜下示0%MSLDP组PC12细胞形态规则，大小均一；2.5%、5.0%MSLDP组PC12细胞数目增多，形态正常；10.0%MSLDP组PC12细胞聚集成片状生长；20.0%、30.0%MSLDP组PC12细胞聚集成片状生长，边缘长出小的棘突，具有分化趋势。0%、2.5%、5.0% MSLDP组VEGF-B蛋白表达水平低于10.0%、20.0%、30.0%MSLDP组(P<0.05)；10.0%MSLDP 组VEGF-B蛋白表达水平低于20.0%MSLDP组(P<0.05)；20.0%MSLDP组VEGF-B蛋白表达水平高于30.0%MSLDP组(P<0.05)。正常对照组、MSLDP干预组PC12细胞存活率高于模型组(P<0.05)。显微镜观察示正常对照组细胞形态规则，大小均一；模型组细胞数量减少，形态不规则，呈凋亡或死亡的萎缩状，有细胞碎片；MSLDP干预组细胞数量明显增多，部分细胞呈拉伸状有棘突。正常对照组VEGF-B蛋白表达水平高于模型组和MSLDP干预组(P<0.05)；模型组VEGF-B蛋白表达水平低于MSLDP干预组(P<0.05)。结论MSLDP可增加 Aβ25-35损伤的 PC12细胞的活性，并对PC12细胞具有保护作用，其机制可能与其可增加VEGF-B蛋白表达水平有关。

阿尔茨海默病；六味地黄汤；血管内皮生长因子类；淀粉样β肽类

宋军营，袁永，王丛笑，等.六味地黄丸含药血清对β-淀粉样蛋白损伤大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的保护作用研究[J].中国全科医学，2017，20(30)：3763-3769.[www.chinagp.net]

SONG J Y,YUAN Y,WANG C X,et al.Protective effects of medicated serum of Liuwei dihuang pill on Aβ25-35-injured rat PC12 cells [J].Chinese General Practice，2017，20(30)：3763-3769.

中医学认为阿尔茨海默病(AD)的病机为肾精衰枯、髓减脑消、神机失用，所以补肾健脑、养肝益血药物在 AD 的治疗中受到广泛关注。现代医学认为脑部血管淀粉样疾病和动脉粥样硬化均可导致脑微循环障碍[1]。临床研究表明，AD患者是大脑微血管疾病的高发人群[2-4]。因此，微血管功能障碍被认为是AD发病机制的重要组成之一，但是β-淀粉样变和微血管功能障碍之间的关系尚不清楚[5]。六味地黄丸是中医名方，由熟地黄、山萸肉、淮山药、茯苓、牡丹皮、泽泻组成，主要功能为滋阴补肾，其可通过改善微循环及脂质代谢等途径防治老年病，这可能与其可改善血管内皮细胞功能有关。血管内皮生长因子(VEGF)是调节血管内皮细胞功能的主要细胞因子，能够与内皮细胞表面受体酪氨酸激酶结合促进血管内皮细胞生成并参与血管重建。本研究采用β-淀粉样蛋白(Aβ)25-35损伤大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)模型，以研究六味地黄丸在AD防治中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 研究时间 2012年3月—2013年4月。

1.2 实验材料 PC12细胞，由昆明理工大学医学部白洁教授赠予。SPF级雄性SD大鼠20只，周龄 12周，平均体质量(250±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司〔SCXK(京)2012-0001〕。六味地黄丸浓缩丸(河南省宛西制药股份有限公司，批号110316)。

1.3 主要试剂及仪器 VEGF-B (美国Epitomics公司)，β-actin(北京中杉金桥生物技术有限公司)，Aβ25-35(美国SIGMA公司)，山羊抗小鼠(北京中杉金桥生物技术有限公司)，MTT(北京索莱宝科技有限公司)，倒置显微镜〔尼康映像仪器销售(中国)有限公司〕，多功能全波长酶标仪(美国Molecular Devices公司)，高速冷冻离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)，蛋白印记检测系统(美国BIO-RAD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组 SD大鼠于河南中医药大学动物实验研究中心适应性饲养1周，饲养环境：通风，明暗交替各12 h，自由进食、进水。按照随机数字表法将20只雄性SD大鼠分为对照组、给药组，每组10只。

1.4.2 六味地黄丸含药血清(MSLDP)制备 六味地黄丸浓缩丸溶于纯水，给药组按照1.08 g/kg剂量灌胃，对照组予以等体积蒸馏水灌胃，2次/d，连续3 d。第4天灌胃后1 h两组均予以10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉采血。取全血于室温下静置2 h，3 000 r/min离心10 min(离心半径9.7 cm)，分离血清，56 ℃、30 min灭活，超净工作台用0.22 μm滤器过滤灭菌，-80 ℃保存备用。

1.4.3 Aβ25-35配制 用无菌超纯水将1 mg Aβ25-35配制成1 000 μmol/L母液，置于37 ℃培养箱中“老化”5 d，120 μl/管分装后(避免反复冻融)于-80 ℃保存，使用前稀释到所需浓度。

1.4.4 MTT法检测PC12细胞存活率

1.4.4.1 细胞培养 用含10%马血清、5%胎牛血清、100 U/ml链霉素和100 U/ml青霉素的RPMI 1640完全培养基培养PC12细胞。在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，隔天换液，3～4 d传代1次，实验均取对数生长期细胞。

本文创新点：

本文通过采用β-淀粉样蛋白(Aβ)25-35损伤大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)构建阿尔茨海默病(AD)模型，并用补肾类中药——六味地黄丸干预AD模型，检测血管内皮生长因子B(VEGF-B)蛋白表达水平以探讨VEGF-B在AD发病机制中的作用，为完善六味地黄丸对AD等老年性疾病的防治提供实验性依据。

1.4.4.2 MTT法 取对数生长期的PC12细胞3份(A、B、C)，分别吹打成单细胞悬液，按2.5×104个/孔，200 μl/孔加入到96孔细胞培养板中，置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养；将上清液吸出，加入培养基(同1.4.4.1)。A中加入不同浓度Aβ25-35，分为0、10、20、40 μmol/L Aβ25-35组，常规培养24 h；B中加入不同浓度MSLDP，分为0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP组，常规培养48 h；C分为正常对照组(不加Aβ25-35和MSLDP)、模型组(加入20 μmol/L Aβ25-35制备AD模型)、MSLDP干预组(加入20% MSLDP+20 μmol/L Aβ25-35)，常规培养24 h；每个浓度设5个平行孔，实验结束前4 h，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，继续培养；1 500 r/min离心5 min(离心半径9.7 cm)，吸掉150 μl上清液，分别加入150 μl 二甲基亚砜(DMSO)，振荡或反复吹打，直至结晶紫溶解完全。酶标仪590 nm测吸光度值(OD值)。细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值×100%。(注：实验组指代10、20、40 μmol/L Aβ25-35组，2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP组，模型组、MSLDP干预组；对照组指代0 μmol/L Aβ25-35组、0%MSLDP组、正常对照组)。显微镜下观察0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP组及正常对照组、模型组、MSLDP干预组PC12细胞形态。

1.5 Western blotting法检测VEGF-B蛋白表达水平 取对数生长期PC12细胞3份(D、E、F)，分别按2×105个/ml的密度接种至35 cm培养皿，细胞贴壁后，D中加入不同浓度Aβ25-35，分为0、10、20、40 μmol/L Aβ25-35组均处理24 h；E中加入不同浓度MSLDP，分为0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0% MSLDP组处理24 h，F分正常对照组、模型组、MSLDP干预组处理细胞24 h。将处理好的细胞用胰酶消化收集，提取总蛋白。使用Bio-Rad公司的蛋白定量试剂盒，应用BCA法检测蛋白质的浓度。进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜(转膜电压为100 V，75 min)。用10%的脱脂奶粉封膜，4 ℃孵育过夜；洗膜，一抗VEGF(1∶1 000)封膜，室温摇床振荡1 h；洗膜，二抗羊抗鼠(1∶1 000)，封膜，室温摇床振荡1 h；洗膜，加入ECL试剂，反应2～4 min，然后用X线底片曝光。

2 结果

2.1 Aβ25-35对PC12 细胞存活率的影响 4组PC12细胞存活率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。0 μmol/L Aβ25-35组PC12细胞存活率高于10、20、40 μmol/L Aβ25-35组，差异有统计学意义(P<0.05)；10 μmol/L Aβ25-35组PC12细胞存活率高于20、40 μmol/L Aβ25-35组，差异有统计学意义(P<0.05)；20μmol/L Aβ25-35组PC12细胞存活率高于40 μmol/L Aβ25-35组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

Table1 Effect of different concentrations of Aβ25-35 on the survival rate of PC12 cells

组别PC12细胞存活率(%)0μmol/LAβ25-35组100.00±0.0010μmol/LAβ25-35组81.33±2.49a20μmol/LAβ25-35组73.64±1.07ab40μmol/LAβ25-35组61.29±0.94abcF值384.568P值<0.001

注：Aβ=β-淀粉样蛋白，PC12细胞=大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞；与0 μmol/L Aβ25-35组比较，aP<0.05；与10 μmol/L Aβ25-35组比较，bP<0.05；与20 μmol/L Aβ25-35比较，cP<0.05

2.2 Aβ25-35对VEGF-B蛋白表达水平的影响 4组VEGF-B蛋白表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。0、10 μmol/L Aβ25-35组VEGF-B蛋白表达水平高于20、40 μmol/L Aβ25-35组，差异有统计学意义(P<0.05)；20 μmol/L Aβ25-35组VEGF-B蛋白表达水平40 μmol/L Aβ25-35组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2、图1)。

2.3 MSLDP对PC12细胞存活率的影响 6组PC12细胞存活率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。0%MSLDP组PC12细胞存活率低于2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP组，差异有统计学意义(P<0.05)；2.5%MSLDP组PC12细胞存活率低于5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP组，差异有统计学意义(P<0.05)；5.0%MSLDP组PC12细胞存活率低于10.0%、20.0%、30.0%MSLDP组，差异有统计学意义(P<0.05)；10.0%MSLDP组PC12细胞存活率低于20.0%、30.0%MSLDP组，差异有统计学意义(P<0.05)；20.0%MSLDP组PC12细胞存活率低于30.0%MSLDP组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

显微镜观察显示：0%MSLDP组PC12细胞形态规则，大小均一；2.5%、5.0%MSLDP组PC12细胞数目增多，形态规则，大小均一；10.0%MSLDP组PC12细胞数目增多明显，细胞聚集成片状生长，形态有拉伸趋势；20.0%、30.0%MSLDP组PC12细胞聚集成片状生长，形态拉伸更明显，并且细胞长出小的棘突，具有分化趋势及神经元特征(见图2)。

2.4 MSLDP对VEGF-B蛋白表达水平的影响 6组VEGF-B蛋白表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。0%、2.5%、5.0% MSLDP组VEGF-B蛋白表达水平低于10.0%、20.0%、30.0%MSLDP组，差异有统计学意义(P<0.05)；10.0%MSLDP组VEGF-B蛋白表达水平低于20.0%MSLDP组，差异有统计学意义(P<0.05)；20.0%MSLDP组VEGF-B蛋白表达水平高于30.0%MSLDP组，差异有统计学意义(P<0.05，见表4、图3)。

Table2 Effect of different concentrations of Aβ25-35 on the protein expression of VEGF-B in PC12 cells

组别VEGF-B0μmol/LAβ25-35组0.67±0.0310μmol/LAβ25-35组0.62±0.0220μmol/LAβ25-35组0.40±0.04ab40μmol/LAβ25-35组0.11±0.01abcF值293.349P值<0.001

注：与0 μmol/L Aβ25-35组比较，aP<0.05；与10 μmol/L Aβ25-35组比较，bP<0.05；与20 μmol/L Aβ25-35组比较，cP<0.05；VEGF-B=血管内皮生长因子B

注：VEGF-B=血管内皮生长因子B；从左到右依次为0、10、20、40 μmol/L β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)组

图1 Aβ25-35对VEGF-B蛋白表达水平的影响

Figure1 Effect of different concentrations of Aβ25-35 on the protein expression of VEGF-B

Table3 Effect of MSLDP on the survival rate of PC12 cells in the 6 MSLDPgroups

组别PC12细胞存活率(%)0%MSLDP组100.00±0.002.5%MSLDP组166.50±3.64a5.0%MSLDP组190.90±5.19ab10.0%MSLDP组199.20±5.50abc20.0%MSLDP组241.60±8.62abcd30.0%MSLDP组259.60±7.15abcdeF值2.383P值<0.001

注：与0%MSLDP组比较，aP<0.05；与2.5%MSLDP组比较，bP<0.05；与5.0%MSLDP组比较，cP<0.05；与10.0%MSLDP组比较，dP<0.05；与20.0%MSLDP组比较，eP<0.05

注：A为0%MSLDP组，B为2.5%MSLDP组，C为5.0%MSLDP组，D为10.0%MSLDP组，E为20.0%MSLDP组，F为30.0%MSLDP组；MSLDP=六味地黄丸含药血清，PC12细胞=大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞

图2 六味地黄丸含药血清对PC12细胞形态的影响(×200)

Figure2 Effect of MSLDP on the cellular morphology of PC12 cells in 6 groups

Table4 Effect of MSLDP on the protein expression of VEGF-B in the 6 groups

组别VEGF-B0%MSLDP组0.31±0.012.5%MSLDP组0.33±0.015.0%MSLDP组0.34±0.0110.0%MSLDP组0.66±0.02abc20.0%MSLDP组0.80±0.01abcd30.0%MSLDP组0.69±0.01abceF值4.488P值0.015

注：与0%MSLDP组比较，aP<0.05；与2.5%MSLDP组比较，bP<0.05；与5.0%MSLDP组比较，cP<0.05；与10.0%MSLDP组比较，dP<0.05；与20.0%MSLDP组比较，eP<0.05

注：从左到右依次为0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP组

图3 六味地黄丸含药血清对PC12细胞VEGF-B蛋白表达水平的影响

Figure3 Effect of different concentrations of MSLDP on the protein expression of VEGF-B

2.5 MSLDP对AD模型PC12细胞存活率的影响 3组PC12细胞存活率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组、MSLDP干预组PC12细胞存活率高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，见表5)。镜下观察：正常对照组细胞形态规则，大小均一；模型组细胞数量减少，形态不规则，呈凋亡或死亡的萎缩状，有细胞碎片；MSLDP干预组细胞数量明显增多，细胞形态相对规则，部分细胞呈拉伸状有棘突，几乎没有碎片(见图4)。

2.6 MSLDP对AD模型VEGF-B蛋白表达水平的影响 3组VEGF-B蛋白表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组VEGF-B蛋白表达水平高于模型组和MSLDP干预组，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组VEGF-B蛋白表达水平低于MSLDP干预组，差异有统计学意义(P<0.05，见表6、图5)。

表5 MSLDP对AD模型损伤PC12细胞存活率的影响

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

Table6 Effect of MSLDP on the protein expression of VEGF-B in the AD model

组别VEGF-B正常对照组0.51±0.02模型组0.26±0.02aMSLDP干预组0.31±0.01abF值181.341P值<0.001

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

注：A为正常对照组，B为模型组，C为MSLDP干预组

图4 六味地黄丸含药血清对AD模型PC12细胞形态的影响(×200)

Figure4 Effect of MSLDP on the cellular morphology of PC12 cells in the AD model

注：从左到右依次为正常对照组、模型组、MSLDP干预组

图5 六味地黄丸含药血清对AD模型VEGF-B蛋白表达水平的影响

Figure5 Effect of MSLDP on the protein expression of VEGF-B in the AD model

3 讨论

AD在中医学属“呆病”“健忘”“虚劳”“郁症”等范畴，将衰老的成因归结于虚，病位在肾，即AD的发生与肾虚关系密切。老年人因耗精过度或虚劳内伤，久病气衰致五脏亏损或失于情志、阴精暗耗皆可致肾精亏损、髓少脑空、元神不得守位，而致神明错乱，精髓逐渐枯萎，遂成呆病，并可呈进行性加剧[6]。肾为先天之本，藏精、生髓、通脑，与脑髓的关系密切，补肾益精填髓为中医治疗AD的重要方法。六味地黄丸是中医名方，始见于宋·钱乙的《小儿药证直诀》，组方为熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、茯苓、牡丹皮，以8∶4∶4∶3∶3∶3比例配伍，补药量重于泻药量，以滋补为主。研究发现六味地黄丸能够改善AD患者的记忆、智力和精神行为[7]；还有研究发现六味地黄丸具有抗氧化应激和炎症作用，能够改善小鼠脑部的记忆细胞和认知功能[8-11]。目前，血管因素对AD发病机制的作用受到越来越多的关注。AD患者脑组织VEGF水平低于正常人，VEGF水平降低可致AD患者脑微血管密度降低、神经元保护功能下降以及大脑微血管调节、血管新生、营养因子渗透等发生改变，加重大脑缺氧[12]。此外，AD患者血清VEGF水平低于正常对照组，而且与AD病情严重程度存在相关性，即VEGF水平越低，AD神经变性病理过程发展越快[13]。Aβ蛋白是老年斑的主要成分，在AD的病理和发展中起决定性作用，其可激活胶质细胞释放炎性因子；同时，在体内炎性修复机制的作用下，将由Aβ产生的炎性反应转变为慢性炎性损伤，导致神经元发生缓慢的、阶段性的凋亡、变性及坏死[14]。有研究发现VEGF能够恢复Aβ引起的血管损伤[15]。本研究将Aβ25-35作用于PC12细胞，观察其对PC12细胞的影响，构建AD模型，并研究六味地黄丸对AD模型中VEGF-B蛋白表达水平的影响，寻找中医防治AD的分子机制。

本研究结果显示，随Aβ25-35浓度的增加，PC12细胞存活率降低；而PC12细胞存活率随MSLDP浓度的增加而增加，说明六味地黄丸能够促进PC12细胞增殖。显微镜观察PC12细胞形态示：随着Aβ25-35浓度增高，PC12细胞数目减少并有少许凋亡，细胞膜完整性降低，细胞质内空泡增多，视野背景细胞碎片增多，漂浮凋亡细胞逐渐增多。经MSLDP干预后PC12细胞存活率明显增加，说明 MSLDP可促进PC12细胞增殖。显微镜下观察PC12细胞形态：随着MSLDP浓度增高，PC12细胞数目增多，细胞聚集成片，形态逐渐拉伸，20.0%、30.0%MSLDP组PC12细胞长出小棘突，有明显分化趋势，表明 MSLDP在一定浓度下有促PC12细胞增殖作用，而且可能对神经元具有保护作用。

研究报道，VEGF诱导血管生成改善了转基因AD小鼠模型的记忆障碍，其还能通过改善血管生存状况恢复AD小鼠的记忆，这说明VEGF在AD神经退行性病变和血管功能障碍中有重要作用[15-16]。本研究结果显示，VEGF-B蛋白表达水平随着Aβ25-35浓度增加依次降低，而随着 MSLDP浓度增加依次增加，并且六味地黄丸能够上调Aβ25-35损伤后PC12细胞的VEGF-B蛋白表达水平，这些暗示了VEGF-B在AD病理过程中发挥重要作用。

模型组PC12细胞存活率明显降低，细胞形态显示细胞数量明显减少，细胞形态改变，有少许碎片，加入MSLDP后细胞数量明显增多，细胞形态恢复正常状态，几乎没有碎片，这些均表明六味地黄丸对Aβ25-35 损伤的PC12细胞有一定的保护作用，并且可能通过调节VEGF-B蛋白表达水平对AD的防治发挥重要作用；提示补肾类中药-六味地黄丸防治AD的分子机制之一是通过上调VEGF表达而发挥作用的，但其具体调节信号通路及其机制尚未完全明确，还需进行深入研究。

综上所述，MSLDP可增加 Aβ25-35损伤的 PC12细胞的活性，并对PC12细胞具有保护作用，其机制可能与其可增加VEGF-B蛋白表达水平有关。

作者贡献：宋军营、袁永、王丛笑进行实验实施、数据收集及处理；张钟允、高爱社进行资料收集整理及对实验评估；宋军营撰写论文；宫洪涛、张振强进行实验设计和指导并对文章负责；刘文弟负责审校。

本文无利益冲突。

本文不足：

血管内皮生长因子(VEGF)与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/AKT)信号通路有密切联系，但本文没有深入研究六味地黄丸对PI3K/AKT信号通路中VEGF表达的影响，后续实验会补充这方面的内容，开拓中医药疾病治疗的新靶点。

[1]王丛笑，宋军营，张振强.VEGF在阿尔茨海默病中相关作用机制的研究[J].中医学报,2015,30(1):109-113.DOI:10.16368/j.issn.1674-8999.2015.01.036.

WANG C X，SONG J Y,ZHANG Z Q.VEGF related mechanisms in alzheimer′s disease research[J].China Journal of Chinese Medicine,2015,30(1):109-113.DOI：10.16368/j.issn.1674-8999.2015.01.036.

[2]章露易,范彦英,陈忠.VEGF与中枢神经系统疾病的关系[J].浙江大学学报(医学版),2009,38(6):644-648.DOI:10.3785 /j.issn.1008-9292.2009.06.016.

HANG L Y,FAN Y Y,CHEN Z.VEGF and central nervous system diseases[J].Journal of Zhejiang University (Medical Sciences)，2009,38(6):644-648.DOI:10.3785 /j.issn.1008-9292.2009.06.016.

[3]李娅,龙慧,楚兰,等.阿尔茨海默病与血管性危险因素关系研究:中国学者海外报道[J].中国现代神经疾病杂志,2015,15(7):518-523.DOI：10.3969/j.issn.1672-6731.2015.07.004.

LI Y,LONG H,CHU L,et al.Studies on the association between Alzheimer′s disease and vascular risk factors:reports from China[J].Chin J Contemp Neurol Neurosurg,2015,15(7):518-523.DOI：10.3969/j.issn.1672-6731.2015.07.004.

[4]韩宛盈,岳少乾,朱金墙.阿尔茨海默病与血管性痴呆发病过程中血管因素的作用及其药物治疗[J].中国老年学杂志,2017,37 (1):216-220.DOI:10.3969 /j.issn.1005-9202.2017.01.096.

[5]BALDASSARRO V A,MARCHESINI A,GIARDINO L,et al.Vulnerability of primary neurons derived from Tg2576 Alzheimer mice to oxygen and glucose deprivation:role of intraneuronal Abeta accumulation and astrocytes[J].Dis Model Mech,2017,10(5):671-678.DOI:10.1242/dmm.028001.

[6]胡梅芳.老年性痴呆从肾虚痰瘀论治[J].浙江中医药大学学报,2009，33(3):375-376.DOI：10.3969/j.issn.1005-5509.2009.03.048.

HU M F.Treat senile dementia from kidney deficiency and sputum stasis [J].Ournal of Zhejiang College of Traditional Chinese Medicine,2009,33(3):375-376.DOI：10.3969/j.issn.1005-5509.2009.03.048.

[7]张春梅.六味地黄丸配合治疗老年痴呆症的临床研究[J].中医临床研究,2012,9(19):88,90.DOI:10.3969/j.issn.1674-7860.2012.19.054.

ZHANG C M.Clinieal research on treating senile dementia with the Liuwei Diuhang pills [J].Clinical Research of Chinese Medicine,2012,9(19):88,90.DOI:103969/jissnl674-7860 2012.19.054.

[8]姬亚杰,张博爱,刘荣丽,等.慢性脑缺血大鼠海马 Notch1 表达的动态变化[J].第三军医大学学报,2011,33(24):2621-2623.DOI：10.16016/j.1000-5404.2011.24.026.

JI Y J,ZHANG B A,LIU R L,et al.Dynamic changes of Notch1 expression in hippocampus of rats with chronic cerebral ischemia[J].Acta Academiae Medicinae Militaris Tertiae,2011,33(24):2621-2623.DOI：10.16016/j.1000-5404.2011.24.026.

[9]孙琳林,王书惠,卢林,等.左归丸与六味地黄丸对衰老大鼠抗氧化能力及海马区超微结构影响的比较研究[J].中医药学报,2012,40(3):140-143.DOI:10.3969/j.issn.1002-2392.2012.03.051.

SUN L L,WANG S H,LU L,et al.Comparative study on the effect of Zuogui pill with Liuweidihuang pill on the antioxygen ation ability and ultrastructure in aging rat＇s hippocampus [J].Acta Chinese Medicine and Pharmacology,2012,40(3):140-143.DOI:10.3969/j.issn.1002-2392.2012.03.051.

[10]赵靓,蔡利军,孟立娜.六味地黄丸对改善智力迟缓型小鼠智力水平的研究[J].浙江中医药大学学报,2013,37(12):1426-1428,1438.DOI：10.16466/j.issn1005-5509.2013.12.021.

[11]陈乔，侯吉华，李青，等.六味地黄丸对老年大鼠行为学的影响及对海马 CAl 区、CA3 区和 S1 Tr 神经元的保护作用[J].时珍国医国药,2013,24(7)：1612-1614.DOI:10.3969/j.issn.1008-0805.2013.07.030.

[12]SOLERTE S B,FERRARI E,CUZZONI G,et al.Decreased release of the angiogenic peptide vascular endothelial growth factor in Alzheimer′s disease:recovering effect with insulin and DHEA sulfate [J].Dement Geriatr Cogn Disord,2005,19(1):1-10.DOI:10.1159/000080963.

[13]MATEO I,LLORCA J,INFANTE J,et al.Low serum VEGF levels are associated with Alzheimer′s disease [J].Acta Neurol Scand,2007,116(1):56-58.DOI:10.1111/j.1600-0404.2006.00775.x.

[14]DEMATTOS R B,LU J,TANG Y,et al.A plaque-specific antibody clears exisiting β-amyloid plaques in Alzheimer′s disease mice [J].Neuron,2012,76 (5):908-920.DOI:10.1016/j.neuron.2012.10.029.

[15]RELIGA P,CAO R,RELIGA D,et al.VEGF significantly restores impaired memory behavior in Alzheimer′s mice by improvement of vascular survival[J].Sci Rep,2013,3:2053.DOI:10.1038/srep02053.

[16]WANG P,XIE Z H,GUO Y J,et al.VEGF-induced angiogenesis ameliorates the memory impairment in APP transgenic mouse model of Alzheimer′s disease[J].Biochem Biophys Res Commun,2011,411(3):620-626.DOI:10.1016/j.bbrc.2011.07.003.

ProtectiveEffectsofMedicatedSerumofLiuweiDihuangPillonAβ25-35-injuredRatPC12Cells

SONGJun-ying1,YUANYong1,WANGCong-xiao2,ZHANGZhong-yun1,GONGHong-tao3,ZHANGZhen-qiang1*,LIUWen-di1,GAOAi-she4

1.ImmunologyLaboratoryofChineseMedicine,HenanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450046,China2.TheThirdAffiliatedHospitalofHenanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450008,China3.TheFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofTCM,Zhengzhou450000,China4.SchoolofBasicMedicalSciences,HenanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450046,China

ObjectiveTo explore the effects and mechanisms of Liuwei dihuang pill(LDP) in the prevention and treatment of alzheimer disease (AD) by studying the protective effects of medicated serum of Liuwei Dihuang Pill (MSLDP) on rat adrenal pheochromocytoma cells (PC12) injured by amyloid-beta peptide 25-35(Aβ25-35).MethodsThis study was conducted from March 2012 to April 2013.Twenty SPF grade SD male rats were selected and divided into the control group and the drug group according to the random number table,10 for each group.MSLDP and Aβ25-35 were prepared.According to the intervention concentration of Aβ25-35 and MSLDP,PC12 cells in logarithmic growth phase were taken and divided into 0,10,20,40 μmol/L Aβ25-35 group and 0%,2.5%,5.0%,10.0%,20.0%,30.0% MSLDP group.Then we took other PC12 cells in logarithmic growth phaseand divided into the normal control group (without the intervention of Aβ25-35 and MSLDP),model group (receiving intervention of 20 μmol/L Aβ25-35 for the preparation of AD model),and MSLDP intervention group (receiving intervention of 20% MSLDP + 20 μmol/L Aβ25-35).The survival rate of PC12 cells in all the groups was detected by MTT.Then we took other PC12 cells in logarithmic growth phase and obtained the same groups by using the above grouping methods and steps.The morphology of PC12 cells in all MSLDP groups,normal control group,model group and MSLDP intervention group were observed under the microscope.The express ion level of vascular endothelial growth factor B (VEGF-B) in PC12 cells in these groups was detected by western blotting.ResultsThe survival rate of PC12 cells in 0 μmol/L Aβ25-35 group was higher than that in the other three Aβ25-35 treated groups(P<0.05);the survival rate of PC12 cells in 10 μmol/L Aβ25-35 group was higher than that of 20,40 μmol/L Aβ25-35 group(P<0.05);the survival rate of PC12 cells in 20 μmol/L Aβ25-35 group was higher than that of 40 μmol/L Aβ25-35 group(P<0.05).The protein expression of VEGF-B was higher in 0,10 μmol/L Aβ25-35 group than in the 20,40 μmol/L Aβ25-35 group(P<0.05),and it was higher in the 20 μmol/L Aβ25-35 group than in the 40 μmol/L Aβ25-35 group(P<0.05).The survival rate of PC12 cells was lower in the 0% MSLDP group than that in other MSLDP groups (P<0.05);the survival rate of PC12 cells in the 2.5% MSLDP group was lower than that of the 5.0%,10.0%,20.0%,30.0% MSLDP group(P<0.05);the survival rate of PC12 cells in the 5.0% MSLDP group was lower than that of 10.0%,20.0%,30.0% MSLDP group(P<0.05);the survival rate of PC12 cells in the 10.0% MSLDP group was lower than that of the 20.0%,30.0% MSLDP group(P<0.05)；the survival rate of PC12 cells in the 20.0% MSLDP group was lower than that of the 30.0% MSLDP group(P<0.05).Microscope observation showed that,the PC12 cells in the 0% MSLDP group were regular in shape and uniform in size;the PC12 cells in 2.5%,5.0% MSLDP group were increased but with normal shape;PC12 cells in 10.0%,20.0%,30.0% MSLDP group displayed aggregated and lamellar growth with small protrusions on the edge and differentiated trend.The protein expression of VEGF-B was lower in 0%,2.5%,5.0% MSLDP group than that in 10.0%,20.0%,30.0% MSLDP group(P<0.05),and it was lower in the 10.0% MSLDP group than in 20.0% MSLDP group(P<0.05),but it was higher in the 20.0% MSLDP group than in the 30.0% MSLDP group(P<0.05).The survival rate of PC12 cells was higher in the normal control group and MSLDP intervention group than that in the model group(P<0.05).Microscope observation demonstrated that,the PC12 cells in the normal control group were regular in shape and uniform in size;the PC12 cells in the model group were reduced and irregular,presenting cellular atrophy or death as well as cellular debris;the PC12 cells in MSLDP intervention group were significantly increased,and part of them were stretched with protrusions.The protein expression of VEGF-B in normal control group was higher than that in the model group and MSLDP intervention group(P<0.05);the protein expression of VEGF-B in model group was lower than that of MSLDP intervention group(P<0.05).ConclusionMSLDP can increase theactivity of the Aβ25-35-injured PC12 cells and protect them,the mechanism might be related to the increase of the protein expression of VEGF-B.

Alzheimer disease;Liuwei dihuang decoction;Vascular endothelial growth factors;Amyloid beta-peptides

R 745.7

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.00.067

2017-05-10；

2017-08-24)

(本文编辑：崔莎)

国家自然科学基金联合基金项目(U1504829)；河南省基础与前沿科学研究项目(14230041023,162300410127)；河南省高校科技创新人才支持计划(13HASTIT027)；河南省科技攻关项目(16102310182)

1.450046河南省郑州市，河南中医药大学中医药免疫学实验室 2.450008河南省郑州市，河南中医药大学第三附属医院 3.450000河南省郑州市，河南中医药大学第一附属医院 4.450046河南省郑州市，河南中医药大学基础医学院

*通信作者：张振强，教授；E-mail:zhang_zhenqiang@126.com

*Correspondingauthor:ZHANGZhen-qiang,Professor;E-mail:zhang_zhenqiang@126.com